肺腺癌预后不良的重要基因CDC20、CCNB2和CDC45

龙焕屏，李光

（中国医科大学附属第一医院放射治疗科，沈阳 110001）

在癌症死亡患者中肺癌占27%，是癌症相关死亡的主要原因［1］。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）已经成为近数十年来最常见的肺癌类型之一，并且LUAD倾向于早期转移，能够导致很高的死亡率［2］。因此，寻找可靠的预后标志物和治疗靶点对提高LUAD的治疗效果非常重要。随着生物技术的发展，可以通过微阵列检测成千上万个基因的表达水平，进一步促进了癌症的研究。本研究通过分析基因表达微阵列数据（GSE33532、GSE32863和GSE43458）探索了LUAD中差异表达基因的相互作用网络以及相关的信号传导途径，最终鉴定出3个核心基因CDC45、CCNB2和CDC20可以作为LUAD的候选生物标志，从而为LUAD的潜在生物学机制和治疗靶标提供有用的信息和方向。

1 材料与方法

1.1 微阵列数据信息

从美国国立生物技术信息中心的基因表达汇编（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中选 取GSE33532、GSE32863和GSE43458的芯片数据，共178例LUAD和98例正常肺组织。

1.2 差异表达基因的筛选

使用GEO2R筛选LUAD和正常肺组织之间的差异表达基因，筛选条件是|logFC|≥ 1和调整P＜ 0.001。然后，使用Venn diagram软件获得3个基因芯片的共同差异表达基因，log FC ＞ 0定义为上调基因，log FC ＜ 0定义为下调基因。

1.3 基因本体（Gene Ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析

使用注释、可视化和集成发现数据库（The Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID）对基因进行分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）、生物过程（biological process，BP）和KEGG分析（P＜ 0.05）。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）的建立和重要模块的分析

通过STRING获取PPI信息。然后，使用Cytoscape检查基因之间潜在的相关性，使用MCODE获得重要模块。

1.5 核心基因的生存分析

通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库评估基因对预后的影响（P＜ 0.05）。

2 结果

2.1 筛选LUAD中差异表达的基因

使用GEO2R，分别从GSE33532、GSE32863和GSE43458中筛选出3 180、1 584、1 011个差异表达基因。使用Venn diagram获得331个共同差异表达基因，其中上调基因68个（图1A），下调基因263个（图1B）。

图1 通过使用Venn diagram获得331个共同差异表达基因Fig.1 331 common differentially expressed genes obtained by Venn diagram

2.2 差异基因的GO和KEGG分析

使用DAVID对331个基因进行GO分析。结果表明：（1）BP方面，上调的基因主要富集在胶原纤维组织、胞质分裂和凋亡过程的正向调控等，下调的基因主要富集在细胞黏附和细胞对激素刺激的反应等；（2）MF方面，上调的基因富集在细胞外基质结构组成和DNA结合、弯曲等，下调的基因则富集在肝素结合和碳水化合物结合等；（3）CC方面，上调的基因明显富集在蛋白质细胞外基质、中体和细胞外泌体等，下调的基因富集在膜筏和蛋白质细胞外基质等。KEGG分析结果显示，上调的基因主要富集在细胞外基质受体相互作用、蛋白质的消化吸收、黏着斑和细胞周期，下调的基因则富集在细胞黏附分子、药物代谢-细胞色素P450、酪氨酸代谢和PPAR信号通路（图2）。

图2 68个上调基因和263个下调基因的GO和KEGG分析Fig.2 GO and KEGG analysis of 68 up-regulated genes and 263 down-regulated genes

2.3 PPI的构建和重要模块分析

通过STRING获取331个共同差异表达基因的PPI信息。使用Cytoscape检查基因之间潜在的相关性，共有291个节点和934层边缘。此外，使用MCODE获得了1个重要模块。该模块包括16个基因，且均为上调基因（图3）。

图3 通过STRING和模块分析构建PPI Fig.3 Building PPI through STRING and module analysis

2.4 使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库进行核心基因的分析

使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库对16个基因进行总生存分析（overall survival，OS），结果显示，13个基因（ASPM，CCNB2，CDC20，CDC45，CENPE，KIAA0101，KIF20A，MELK，PRC1，TOP2A，TPX2，TYMS，UBE2T）的高表达与LUAD的OS更差相关（均P＜ 0.05）。

2.5 13个核心基因的KEGG途径分析

13个基因的KEGG分析结果表明，CDC45、CCNB2和CDC20显著富集于细胞周期途径中（P=0.001 929 455，FDR=1.234 859 464）。

2.6 CDC45、CCNB2和CDC20的表达与不同临床病理特征肺癌患者预后的关系

使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库分析CDC45、CCNB2和CDC20的表达与不同临床病理特征肺癌患者临床预后的关系。结果显示，CDC20的高表达与男性、女性、TNM分期中的Ⅰ期、N2期、吸烟、腺癌和手术切缘阴性患者的OS和无进展生存期（free progression survival，FPS）较差显著 相关（表1），CCNB2的高表达与男性、TNM分期中的Ⅰ期、吸烟、未吸烟、腺癌和手术切缘阴性患者的OS和FPS较差显著相关（表2），CDC45的高表达与男性、TNM分期中的Ⅰ期、吸烟、腺癌、手术切缘阴性和未化疗患者的OS和FPS较差显著相关（表3）。这些结果表明，CDC45、CCNB2和CDC20的表达水平可能影响肺癌患者的预后，可望成为LUAD的预后标志物。

表1 CDC20的表达与不同临床病理特征肺癌患者临床预后的关系Tab.1 Relationship between the expression of CDC20 and clinical prognosis of lung cancer patients with different clinicopathological factors

表2 CCNB2的表达与不同临床病理特征肺癌患者临床预后的关系Tab.2 Relationship between the expression of CCNB2 and clinical prognosis of lung cancer patients with different clinicopathological factors

表3 CDC45的表达与不同临床病理特征肺癌患者临床预后的关系Tab.3 Relationship between the expression of CDC45 and clinical prognosis of lung cancer patients with different clinicopathological factors

3 讨论

为了确定在LUAD中有用的预后生物标志物，本研究使用生物信息学方法从GEO数据库中选取了GSE33532、GSE32863和GSE43458芯片，最终得到CDC45、CCNB2和CDC20在细胞周期途径中显著富集，并且这3个基因的表达与不同临床病理特征肺癌患者的预后有关，表明这3个基因可能作为LUAD的预后生物标志物和潜在治疗靶点。

CDC20突变可导致有丝分裂异常停止，从而导致后期染色体分离异常［3］。CDC20在多种肿瘤中高表达，如卵巢癌［4］、肝细胞癌［5］、胃癌［6］、乳腺癌［7］，并与患者的预后有关。下调CDC20可增加癌细胞对放疗和化疗的敏感性［8］。CCNB2通过激活CDK1激酶来触发细胞周期G2/M的转变［9］。CCNB2在多种癌症中高表达，如前列腺癌［10］、乳腺癌［11］、。CCNB2mRNA在癌症患者血清中高表达，且与癌症的分期和转移状态有关［12］。CDC45在启动DNA复制中起着至关重要的作用［13］，且在多种肿瘤中高表达，如宫颈癌［14］，并且CDC45可能是各种恶性肿瘤增殖的标志物［15］。

大量研究证明，CDC20、CCNB2和CDC45与多种肿瘤进展密切相关。本研究通过生物信息学分析发现，CDC20、CCNB2和CDC45在LUAD的预后过程中可能起关键作用，可能是潜在的治疗靶标。但是，这些预测还需要通过一系列实验加以验证。本研究的结果为LUAD的潜在生物学机制和治疗靶标提供了一些有用的信息和方向。