衍生化-顶空固相微萃取-气相色谱法测定大鼠粪便中游离短链脂肪酸

2021-09-27张晓伟孙鑫李秀娟潘思轶

华中农业大学学报(自然科学版) 2021年5期

张晓伟，孙鑫，李秀娟，潘思轶

华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070

短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)是肠道菌群重要代谢产物，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸[1-2]。研究发现，约5%～10%的SCFAs被排泄在粪便中，90%以上的SCFAs在盲肠和结肠中被吸收，参与生命活动代谢，在维持肠道稳态、调节宿主代谢及免疫应答和一些相关性疾病中发挥重要作用[3-4]。粪便是目前研究SCFAs应用最为广泛的生物样品，其SCFAs浓度与结肠状态和肠道菌群密切相关，是肠道菌群监测、肠道疾病及代谢性疾病早期诊断的重要手段[5-6]。然而，SCFAs理化性质独特，含量较低且粪便等生物样品基质复杂等因素使得SCFAs的准确定量十分困难[7]。因此，建立操作简单、灵敏度高及分析成本低的检测方法对于粪便中SCFAs的分析具有重要意义。

气相色谱法 (gas chromatography,GC) 是目前分析SCFAs最为常用的方法[8-10]，但是SCFAs极性较强，易在色谱柱中产生吸附(尤其在低浓度时)，导致检测结果的重现性和准确度较差[9]。因此，常常会将SCFAs衍生化后再通过有机溶剂萃取，经脱水或浓缩后进行GC分析，但此过程中SCFAs 衍生物极易逸失，回收率偏低[10]，而且过量衍生试剂也会对色谱柱造成损害。采用固相微萃取技术(solid-phase microextraction,SPME)可以改善上述状况，还可以大大提高方法的灵敏度，被广泛应用于食品、医药及生物领域中痕量化合物的检测[11-12]。但是衍生化SPME结合用于分析生物样品中SCFAs的报道并不多，并且还存在一些不足：回收率偏低、准确度不佳、衍生反应条件苛刻、安全性差、衍生操作繁琐、耗时及分析成本高等[13-16]。

目前用于SCFAs衍生的试剂有五氟苄基溴(pentafluorobenzyl bromide,PFBBr)[17-18]、三甲基甲硅烷试剂(trimethylsilyl,TMS)[19]、烷基氯甲酸酯类[20-23]等。其中，烷基氯甲酸酯类因衍生操作简单、快速、条件温和、价格便宜等优点，被广泛用于SCFAs衍生[20]。Furuhashi等[20]和Zheng等[21]发现氯甲酸丙酯(propylchloroformate,PCF)衍生效率较佳，衍生物在色谱中分离好，获得了较好的分析结果。但是他们使用粪便提取液进行衍生化，再采用液液萃取分离纯化，操作过程极为繁琐，需用大量有机试剂进行多次分离转移，目标物极易逸失，导致分析物回收率偏低，且检出限较高，可能无法满足生物样品中痕量SCFAs的检测[20-21]。

因此，为改善传统GC法不足，更加适用于SCFAs的痕量检测，本研究以PCF为衍生试剂，结合HS-SPME，建立基质内衍生-顶空固相微萃取-气相色谱方法用于大鼠粪便中游离SCFAs的测定，以期为肠道菌群与健康研究提供技术支撑，并为血液及组织等生物样品中SCFAs的痕量检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鼠粪便由华中农业大学实验动物中心提供。

乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、2-甲基戊酸(>98%)及PCF(>99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正丙醇、吡啶(分析纯)，上海国药集团化学试剂有限公司；超纯水。

使用超纯水配制SCFAs混合标准储备溶液，每种标准物的质量浓度为1 mg/mL。将储备溶液进一步稀释至一系列浓度制备混合标准工作溶液。在超纯水中制备2-甲基戊酸储备溶液(0.1 mg/mL)，将其用作内标(IS)。所有标准储备溶液和所有工作溶液均存储于4 ℃。

1.2 仪器与设备

SP-7890型气相色谱仪(配氢火焰离子化检测器，FID)，山东鲁南瑞虹化工有限公司；N2000色谱工作站，浙江大学智达信息工程有限公司；SE-54毛细管柱(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)，兰州中科安泰分析科技有限公司；CT-1型氮氢空气发生器，武汉科林普丰仪器有限公司；QL-861型漩涡混合器，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；XHF-D高速分散器内切式匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，武汉德力祥仪器设备有限公司。

65 μm羟基硅油-甲基丙烯酸丁酯-二乙烯苯基 (hydroxy-terminated silicone oil-butyl methacrylate-divinylbenzene,OH-TSO-BMA-DVB)萃取头参考文献[24]制备。

气相色谱条件：以高纯氮气为载气，柱头压0.10 MPa，空气0.095 MPa，氢气0.065 MPa，尾吹气0.075 MPa，分流比为20∶1。进样口温度280 ℃，FID温度290 ℃。升温程序：初始温度70 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至120 ℃，以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

1.3 粪便中SCFAs提取、衍生和顶空固相微萃取操作方法

随机收集Wistar大鼠的新鲜粪便于离心管内，密封并于-80 ℃冻存。粪便基质内SCFAs的提取参考Zheng等[21]的方法并加以调整。取-80 ℃ 冻存的粪便，以料液质量比1∶10，加入超纯水(含 10 μg/mL 的2-甲基戊酸作为内标)，匀浆10 min。称取1.1 g样品悬浊液，加入NaOH溶液调节pH值为8，依次加入100 μL吡啶、300 μL丙醇和100 μL PCF，涡旋2 min进行衍生。衍生完毕后，加入盐酸调节溶液pH值为3，置于恒温加热磁力搅拌器中，转速1 000 r/min、温度60 ℃，采用OH-TSO-BMA-DVB萃取头萃取30 min，然后取出萃取头于280 ℃ 下GC气化室解吸5 min。所有试验均做3次平行，结果取平均值。

取-80 ℃ 冻存的粪便，以料液质量比1∶4加入超纯水(含 10 μg/mL 的2-甲基戊酸作为内标)，匀浆10 min，加入一定浓度的混合标准液涡旋混匀，在4 ℃下放置12 h以模拟真实样品，再加入一定量超纯水(含 10 μg/mL 的2-甲基戊酸)使以料液质量比为1∶10。按照上述操作，分别对影响衍生的因素(pH、吡啶、丙醇及PCF)和顶空固相微萃取的因素(萃取温度、萃取时间、pH及转速)进行优化。

1.4 方法建立与评价

采用内标标准加入法定量。按本文“1.3”方法在样品中加入一系列不同浓度混合标准溶液，加入内标，在4 ℃下放置12 h，按照最佳条件进行衍生和HS-SPME操作。以各组分加标浓度为横坐标，以各组分峰面积和内标物峰面积之比的平均值为纵坐标建立定量标准曲线。

根据3δ/S(δ为仪器空白响应值的标准偏差，S为采用不含内标的标准加入法建立的校正曲线的斜率)求得方法的检出限，定量限(limit of quantification,LOQ)为10δ/S。

通过内标标准加入法定量，采用绘制的标准曲线，曲线与横坐标的交点的绝对值即为真实样品中SCFAs的浓度。采用内标标准加入法计算试验方法的回收率。在真实样品中分别添加各SCFAs线性范围内高、中、低3个浓度的混合标准溶液，在最优条件下，重复测定3次得到各组分峰面积与内标峰面积比值的平均值，代入标准曲线方程中计算出浓度，与加标浓度的比值即为方法的加标回收率。精密度用相对标准偏差(RSD)表示。

1.5 数据处理

数据处理采用Excel 2016版本软件，绘图采用ChemDraw 19.0和Origin 2018版本软件。

2 结果与分析

2.1 粪便中SCFAs的衍生条件优化

图1显示了SCFAs的PCF衍生过程。为了获得满意的衍生化效果和萃取效果，对衍生条件进行了优化。

1)衍生辅助方式。SCFAs衍生效果与衍生试剂添加速率及衍生体系的摇动程度有关。为此，比较了超声和涡旋2种辅助方式，如图2所示，涡旋更有利于粪便中SCFAs的衍生。进一步考察了涡旋时长对衍生反应的影响，发现涡旋1 min即可满足衍生需要，但是当涡旋2 min时，结果的重现性更好，因此选择涡旋2 min用于后续研究。

图1 氯甲酸丙酯衍生短链脂肪酸的示意图Fig.1 Schematic representation of derivatization of SCFAs with PCF

1：乙酸； 2：丙酸； 3：异丁酸； 4：丁酸； 5：异戊酸； 6：戊酸； 7：己酸。下同。1:Acetic acid; 2:Propionic acid; 3:Isobutyric acid; 4:Butyric acid; 5:Isovaleric acid; 6:Valeric acid; 7:Caproic acid. The same as below.

2)pH。体系pH是影响衍生化反应的重要因素之一。在最初的试验中发现，当pH过高时，PCF水解，衍生效果较差，各目标物的萃取量较低。因此，将衍生体系pH值分别设置为6、7、8、9和10，考察pH值对衍生反应的影响。如图3所示，当溶液pH值在8～9时，衍生效果较佳。综合考虑，选择pH 8用于后续试验。

3)吡啶加入量。吡啶是烷基氯甲酸酯类衍生化反应中常用的催化剂。图4考察了不同吡啶加入量对粪便中SCFAs衍生的影响。当吡啶加入量从50 μL增加至100 μL时，所有SCFAs的衍生率大幅度上升，在100～150 μL时衍生率上升较慢，而后开始下降。这是因为吡啶呈碱性，过多使用吡啶会影响体系pH，导致衍生效果变差；而且过多的吡啶会损坏萃取涂层，使涂层萃取效果下降。综合考虑，选择100 μL吡啶用于后续试验。

图3 pH对粪便中游离SCFAs衍生的影响Fig.3 The effect of pH on the derivatization of free SCFAs in feces

图4 吡啶加入量对粪便中游离SCFAs衍生的影响Fig.4 The effect of pyridine addition on the derivatization of free SCFAs in feces

4)丙醇加入量。过量的丙醇可以使衍生反应完全，但是丙醇用量过多，会降低衍生体系极性，增加衍生物在溶剂中的溶解度，减少衍生物萃取量。图5考察了丙醇对SCFAs衍生反应的影响，选择300 μL丙醇用于后续试验。

图5 丙醇加入量对粪便中游离SCFAs衍生的影响Fig.5 The effect of propanol addition on the derivatization of free SCFAs in feces

5)氯甲酸丙酯加入量。衍生试剂的用量对衍生反应的影响比较复杂。图6考察了PCF加入量对粪便中SCFAs衍生的影响，发现当衍生试剂用量大于100 μL时，衍生物的萃取量下降。过多的衍生试剂会产生更多的副产物，干扰衍生反应进行，也影响涂层对衍生物的萃取效果，造成衍生试剂峰拖尾，导致背景噪音增加，对衍生物的检测造成影响。所以，选择100 μL PCF用于后续研究。

图6 氯甲酸丙酯加入量对粪便中游离SCFAs衍生的影响Fig.6 The effect of propylchloroformate addition on the derivatization of free SCFAs in feces

2.2 顶空固相微萃取条件优化

1)萃取温度。萃取温度是影响SPME的重要因素之一。如图7所示，萃取温度升高会加快SCFAs衍生物从样品基质向顶空的传递速率，增强了涂层的萃取效果，但是当温度继续升高，分析物在涂层与基质间的分配常数降低，导致分析物的萃取量下降，而且温度过高也会导致衍生物的水解，降低衍生物的萃取量。因此，选择萃取温度为50 ℃用于后续研究。

图7 温度对粪便中游离SCFAs衍生物萃取的影响Fig.7 The effect of temperature on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

2)萃取时间。由图8可知，随着萃取时间的增加，各SCFAs衍生物的萃取量逐渐增加，在40 min达到萃取平衡；当继续延长萃取时间到70 min,各目标物的重现性变差，甚至乙酸的萃取量开始下降，可能是长时间的水浴加热导致衍生物开始水解造成。所以，选择40 min作为萃取时间用于后续研究。

图8 萃取时间对粪便中游离SCFAs衍生物萃取的影响Fig.8 The effect of extraction time on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

3)搅拌速度。搅拌可以提高分析物的传递速率，缩短萃取时间，提高萃取效果，但搅拌时一定要保持速度的均匀性和一致性，否则将会导致分析物的萃取量下降或者重复性变差。由图9可知，随着搅拌速度增加，SCFAs衍生物的萃取量逐渐增加，并在转速为1 000 r/min时，达到最佳萃取效果；当继续提高转速时，由于转速过高，磁子不均匀转动甚至跳动，从而导致各目标物的萃取量下降。

图9 转速对粪便中游离SCFAs衍生物萃取的影响Fig.9 The effect of rotating speed on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

4)pH。pH对衍生反应和SPME的影响是不同的。图10反映了衍生后体系的pH对SCFAs衍生物萃取的影响。衍生完成后体系的pH呈弱酸性，在4.19左右，通过加入一定浓度的NaOH溶液或HCl溶液调节体系pH，发现当pH为3.46时，涂层对衍生物的萃取效果最佳。当pH值小于或者大于3.46时，衍生物的萃取量明显下降，可能因为pH较低或较高会导致SCFAs衍生物的水解，或导致衍生物在溶液中电离，影响萃取。

图10 不同pH对粪便中游离短链脂肪酸衍生物萃取的影响Fig.10 The effect of pH on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

2.3 方法建立与评价

在大鼠粪便悬浊液中添加不同浓度的SCFAs混合标准溶液及内标，在最佳衍生条件和顶空固相微萃取条件下，建立氯甲酸丙酯衍生-顶空固相微萃取-气相色谱检测方法，结果见表1。7种SCFAs的线性范围很宽，决定系数R2均大于0.99，所建方法的LOD在0.133～0.420 μmol/kg，LOQ在0.444～1.400 μmol/kg，连续5次重复试验的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在7.63%～12.84%。

表1 7种短链脂肪酸的线性范围、决定系数、检出限、定量限和精密度 Table 1 Linear linearities,coefficients of determination,LOD,LOQ and precision of 7 kinds of SCFAs

随机收集大鼠粪便，按照所建方法测定其中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的含量分别为12.51、6.26、0.36、1.80、0.35、0.17和0.61 μmol/g。

向该样品中添加高、中、低3种浓度的混合标准溶液，计算加标回收率，以验证方法的准确性，结果如表2所示。除异戊酸和己酸的低浓度加标回收率较低外，该方法的加标回收率都在65.42%～117.69%，RSD≤11.60%，说明该方法的准确度和精密度较好。由图11A和11B可知，该方法用于实际样品和加标样品(每种SCFAs的添加量均为500 μg/g) 分析时，7种SCFAs在此衍生条件下，衍生效果较好，谱图较为干净，没有衍生试剂峰拖尾及背景噪音增加现象，衍生物分离度好，不会对衍生物的检测造成影响。

表2 方法的回收率与精密度 Table 2 Recovery and precision of the proposed method

IS：内标物2-甲基戊酸。IS:Internal standard 2-methyl valeric acid.

3 讨论

本研究以PCF为衍生试剂，建立了衍生化-顶空固相微萃取-气相色谱法分析大鼠粪便中游离短链脂肪酸。由表3可知，相对于现有的SPME法、衍生化-液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)-直接进样法[18-19]及LLE-直接进样法[25-26]等方法，本方法具备操作简单、快速、省时、精密度好、灵敏度高等优点。同时本方法采用基质内衍生，结合HS-SPME进行富集萃取，有效减少了大量有机试剂的使用及在分离提取过程中衍生物的损失，降低了过量衍生试剂对色谱柱的损害。此外，本方法对仪器要求不高，采用GC-FID设备即可满足粪便中SCFAs的检测需求。

将本方法用于随机收集的大鼠粪便中SCFAs的检测，测得其中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的含量分别为12.51、6.26、0.36、1.80、0.35、0.17和0.61 μmol/g。而Fiorini等[27]在大鼠粪便中测得上述物质含量及范围分别为58.99(27.31～108.12)、8.93(4.44～15.58)、2.43(1.45～4.20)、1.43(0.91～2.18)、0.41(0.26～0.62)、0.67(0.42～1.07)和0.39(0.26～0.60) μmol/g；Scortichini等[26]在大鼠粪便中测得上述物质含量及范围分别为135.00(118.10～161.60)、15.70(13.30～19.40)、1.80(1.00～2.20)、34.90(26.00～47.80)、2.00(1.60～2.20)、2.50(1.70～2.90)和2.30(1.40～3.10) μmol/g，3种方法所得结果相差很大，而本方法测得的结果与Fiorini等[27]的结果较为接近，但也存在差异，这可能是样品来源不同造成的，而且样品收集、保存方法也会造成影响。

研究表明在正常成年人粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的平均浓度分别为40、15、13、2、2.5、2.0和0.5 mmol/kg粪便[5]，说明所建立的方法能够满足人类粪便中SCFAs的检测需求。相比于粪便，血液、生物组织等生物样品中SCFAs的丰度及含量更低，检测更为困难。将本方法与目前现有的血液中的SCFAs检测方法[19,28]相比，发现本方法亦可满足血液中SCFAs的检测需求，不过，仍需要进一步探究本方法在血液、组织等生物样品中检测的适用性，但其对血液、组织等生物样品中的SCFAs痕量检测也提供了参考价值。