茯苓酸对舌鳞状细胞癌细胞CAL⁃27 增殖、凋亡及细胞周期的影响

樊燕青，孙兰池，李大鹏

（1.昆明医科大学，云南 昆明650500； 2.大同市第三人民医院口腔科，山西 大同 037000）

舌鳞状细胞癌是常见的恶性肿瘤，约占口腔恶性肿瘤的40%［1］。舌鳞状细胞癌恶性程度高，浸润性强，易发生淋巴结转移。目前，舌鳞状细胞癌的治疗主要采取以手术为主的综合治疗，但患者预后较差，5 年生存率低［2］，因此，寻找用于治疗舌鳞状细胞癌的新药具有积极意义。茯苓酸（pachymic acid，PA）是中药茯苓的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效［3］。近年来，茯苓酸的抗肿瘤作用备受关注。研究显示，茯苓酸可抑制肾癌、胃癌、膀胱癌等肿瘤中细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡［4⁃6］。然而，茯苓酸在舌鳞状细胞癌的作用及其调控机制还未知。本研究以舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞为研究对象，主要探讨了茯苓酸对CAL⁃27 细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响及。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 茯苓酸，货号MR80187，纯度≥98%，20 mg／支，上海铭睿生物科技有限公司（准确称取0.529 mg茯苓酸于10 mL 量瓶中，加入10 μL 二甲基亚砜，茯苓酸溶解后超纯水定容至10 mL，配制为100 μmol／L 母液，使用时培养基稀释为所需浓度）。DMSO，国药编号30072418，国药集团化学试剂有限公司（取10 μL DMSO用超纯水定容至10 mL，配制1%DMSO 溶液，使用时用培养基稀释10 倍）。舌鳞状细胞癌细胞CAL⁃27，中国科学院上海细胞库；胎牛血清（FBS，批号20190510）、RPMI 1640 培养基（批号20190311）、膜联蛋白V（Annexin V）⁃异硫氰酸荧光素（FITC）／碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒（批号20190421）、细胞周期试剂盒（批号201900324）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（批号20190329），北京索莱宝生物科技有限公司；四甲基噻唑蓝（MTT）和胰蛋白酶，美国Sigma 公司；LipofectamineTM2000 试剂盒，美国Invitrogen 公司；兔抗人细胞周期蛋白依赖性激酶Ⅱ（CDK2，批号20190225）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1，批号20181229）、活化的半胱天冬酶⁃3（Cleaved caspase⁃3，批号20181225）和CXC 趋化因子受体4（CXCR4，批号20190123）多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；活化的多聚ADP 核糖多聚糖（Cleaved PARP）抗体，批号20190126，武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CAL⁃27 细胞培养和转染 复苏CAL⁃27 细胞，用含10% FBS 的RPMI 1640 培养基培养CAL⁃27 细胞。取对数期CAL⁃27 细胞接种至6 孔板中（1.0×105／孔），培养24 h 后弃培养基。利用LipofectamineTM2000 试剂盒，分别转染CXCR4 过表达载体（pcDNA⁃CXCR4）及空载体（pcDNA）至CAL⁃27 细胞。转染12 h 后，弃培养液，重新加含10%FBS 的RPMI 1640 培养基。再培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖 CAL⁃27 细胞或转染pcDNA⁃CXCR4、pcDNA 的CAL⁃27 细胞均接种于96 孔板中（1.0×104个），培养12 h 后分组处理。CAL⁃27 细胞分为空白组、0.1% DMSO 组、茯苓酸2 μmol／L 组、茯苓酸4 μmol／L 组和茯苓酸8 μmol／L 组，其中空白组细胞用常规培养基干预48 h，0.1% DMSO 组细胞用含0.1% DMSO 的培养基干预48 h，茯苓酸2 μmol／L 组、茯苓酸4 μmol／L 组、茯苓酸8 μmol／L组细胞分别用含2、4、8 μmol／L［7］茯苓酸的培养基干预48 h。转染pcDNA⁃CXCR4、pcDNA 的CAL⁃27 细胞均用含8 μmol／L 茯苓酸的培养基干预48 h，并分别记为茯苓酸＋pcDNA⁃CXCR4 组、茯苓酸＋pcDNA 组。培养结束后，每孔加20 μL MTT（5 mg／mL）。孵育4 h 后，弃培养基，加150 μL DMSO，混合均匀，于酶标仪490 nm 处测OD。细胞存活率＝（OD实验组／OD对照组）×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 CAL⁃27 细胞或转染pcDNA⁃CXCR4、pcDNA 的CAL⁃27 细胞接种于24 孔板中（2.5×104个），培养12 h 后，按照“1.2.2”分组处理。培养结束后，弃培养基，收集各组细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2 次后，加500 μL 结合缓冲液，重悬细胞。加10 μL Annexin V⁃FITC，室温避光孵育10 min。再加5 μL PI，室温避光孵育5 min 后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 CAL⁃27 细胞或转染pcDNA⁃CXCR4、pcDNA 的CAL⁃27 细胞接种于24 孔板中（2.5×104个），培养12 h 后按“1.2.2”项下方法分组处理，培养结束后弃培养基，收集各组细胞。用PBS 液清洗2 次后，加70% 乙醇4 ℃固定24 h，离心（2 000 r／min、5 min），弃上清，加PBS 重悬细胞，离心（2 000 r／min、5 min），弃上清，加100 μL RNase A 重悬细胞，37 ℃水浴30 min 后，加400 μL PI，4 ℃避光孵30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 Western blot 法检测 细胞中 CyclinD1、CDK2、Cleaved PARP、Cleaved caspase⁃3 和CXCR4 蛋白表 达CAL⁃27 细胞或转染pcDNA⁃CXCR4、pcDNA 的CAL⁃27 细胞接种于24 孔板中（2.5×104个），培养12 h 后按“1.2.2”项下方法分组处理，培养结束后弃培养基，收集各组细胞。用RIPA 蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，经BCA 法定量、行十二烷基磺酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜及封闭后，分别用CyclinD1（1 ∶ 500）、CDK2（1 ∶ 500）、Cleaved PARP（1 ∶1 000）、Cleaved caspase⁃3（1 ∶1 000）、CXCR4（1 ∶1 000）和β⁃actin（1 ∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜。洗膜后，再用加入辣根过氧化酶标记的二抗IgG（1 ∶2 000）37 ℃孵育1 h。滴加显影液，避光显影后，曝光拍照，Image J 软件分析目的蛋白相对于β⁃actin 的表达。

1.3 统计学分析 利用SPSS 22.0 软件分析实验数据。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度茯苓酸对舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞增殖的影响 由表1 可见，与空白组比较，0.1% DMSO 组舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞存活率无变化（P＞0.05）；与0.1%DMSO 组比较，不同剂量茯苓酸组舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞存活率降低（P＜0.05）。

表1 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞增殖的影响（， n＝9）

表1 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞增殖的影响（， n＝9）

注：与0.1% DMSO 组比较，*P＜0.05。

2.2 不同浓度的茯苓酸对舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞凋亡的影响 由图1、表2 可见，与空白组比较，0.1% DMSO组舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase⁃3 蛋白表达无变化（P＞0.05）；与0.1%DMSO 组比较，不同剂量茯苓酸组舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase⁃3 蛋白表达升高（P＜0.05）。

表2 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞凋亡的影响（， n＝9）

注：与0.1%DMSO 组比较，*P＜0.05。

图1 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞凋亡和Cleaved caspase⁃3、Cleaved PARP 蛋白表达的影响

2.3 不同浓度的茯苓酸对舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞周期的影响 由图2、图3、表3 可见，与空白组比较，0.1%DMSO 组CAL⁃27 细胞G0⁃G1 期、S 期、G2⁃M 期细胞数及CyclinD1 和CDK2 蛋白水平无明显变化（P＞0.05）；与0.1% DMSO 组比较，不同剂量茯苓酸组G0⁃G1 期细胞数升高（P＜0.05），S 期和G2⁃M 期细胞数降低（P＜0.05），CyclinD1 和CDK2 蛋白表达降低（P＜0.05）。

表3 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞周期的影响（， n＝9）

表3 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞周期的影响（， n＝9）

注：与0.1%DMSO 组比较，*P＜0.05。

图2 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞中CyclinD1 和CDK2 蛋白表达的影响

图3 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞周期的检测

2.4 不同浓度的茯苓酸对舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞CXCR4 表达的影响 由图4、表4 可见，与空白组比较，0.1% DMSO 组舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞中CXCR4 蛋白表达无变化（P＞0.05）。与0.1% DMSO 组比较，不同剂量茯苓酸组舌鳞状细胞CAL⁃27 细胞中CXCR4 蛋白表达降低（P＜0.05）。

表4 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞CXCR4 表达的影响（， n＝9）

表4 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞CXCR4 表达的影响（， n＝9）

注：与0.1%DMSO 组比较，*P＜0.05。

图4 不同浓度的茯苓酸对CAL⁃27 细胞中CXCR4 蛋白表达的影响

2.5 过表达CXCR4 降低茯苓酸对舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞增殖和细胞周期的影响 由图5、图6、表5 可见，与茯苓酸＋pcDNA 组比较，茯苓酸＋pcDNA⁃CXCR4 组CAL⁃27 细胞CXCR4 蛋白表达和细胞存活率升高（P＜0.05），G0⁃G1 期细胞数降低（P＜0.05），S 期和G2⁃M 期细胞数升高（P＜0.05），CyclinD1 和CDK2 的蛋白表达升高（P＜0.05）。

表5 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27 细胞增殖和细胞周期的影响（， n＝9）

表5 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27 细胞增殖和细胞周期的影响（， n＝9）

注：与0.1% DMSO 组比较，*P＜0.05；与茯苓酸＋pcDNA 组比较，＃P＜0.05。

图5 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27细胞中CXCR4 蛋白表达的影响

图6 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27 细胞周期的影响

2.6 过表达CXCR4 降低茯苓酸促进舌鳞状细胞癌CAL⁃27细胞凋亡 由图7、表6 可见，与茯苓酸＋pcDNA 组比较，茯苓酸＋pcDNA⁃ CXCR4 组舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase⁃3 蛋白表达降低（P＜0.05）。

图7 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27 细胞凋亡及Cleaved caspase⁃3 和Cleaved PARP 蛋白表达的影响

表6 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27 细胞凋亡的影响（， n＝9）

表6 茯苓酸对过表达CXCR4 的CAL⁃27 细胞凋亡的影响（， n＝9）

注：与0.1%＋DMSO 组比较，*P＜0.05；与茯苓酸＋pcDNA 组比较，＃P＜0.05。

3 讨论

舌鳞状细胞癌具有较高的发病率，且易发生转移［8］。目前，舌鳞状细胞癌以手术治疗为主，但多数患者术后存在面容改变及部分颜面功能丧失的情况，生活质量受到影响。舌鳞状细胞癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因的复杂过程。细胞的异常增殖和凋亡在肿瘤的发生发展中起重要作用，因此，寻找抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的药物对于治疗舌鳞状细胞癌及改善患者预后均具有重要意义。

茯苓酸是茯苓的主要活性成分，其抗肿瘤作用受到广泛作用。研究显示，茯苓酸可抑制胃癌SGC⁃7901 细胞的活力，诱导SGC⁃7901 细胞的G0－ G1细胞周期阻滞和细胞凋亡，具有一定的抗胃癌作用［9］。本研究显示，茯苓酸作用舌鳞状细胞癌CAL⁃27 细胞后，CAL⁃27 细胞存活率降低，G0⁃G1期细胞数增加，而S 期和G2⁃M 期细胞数降低，这说明茯苓酸可阻滞CAL⁃27 细胞周期进程，抑制细胞增殖。此外，茯苓酸作用CAL⁃27 细胞后，细胞凋亡率明显升高，说明茯苓酸可诱导CAL⁃27 细胞凋亡。上述结果说明茯苓酸也发挥抗舌鳞状细胞癌的作用，是治疗舌鳞状细胞癌的潜在药物。

细胞增殖受细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的调控［10］。CyclinD1 可促进细胞周期由G1期向S 期转变，缩短细胞周期，加速细胞增殖［11］。CDK2 与相应的Cyclin 结合后被激活，使细胞通过G1／S 期检验点并进入S 期。诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的一种途径。PARP 是一类蛋白质翻译修饰酶，参与调控细胞凋亡［12］。PARP 被过度激活时，可引起细胞能量耗竭进而引起细胞凋亡［13］。caspase 级联反 应参与 细胞凋 亡，caspase⁃3 是caspase 级联反应的关键调控分子，其被活化后执行细胞凋亡。本研究显示，茯苓酸作用CAL⁃27 细胞后，细胞中CyclinD1 和CDK2 蛋白表 达降低，而Cleaved PARP 和Cleaved caspase⁃3 蛋白表达升高，说明茯苓酸可通过调控CyclinD1、CDK2 及Cleaved PARP 和Cleaved caspase⁃3 蛋白表达抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

CXCR4 是典型的G 蛋白偶联受体，与子宫内膜癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关［14⁃16］。Duan等［17］研究显示，沉默CXCR4 表达可在体外阻碍舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，且在体内通过抑制基质金属蛋白酶2／9 的蛋白表达、促进E⁃钙粘蛋白表达进而抑制肿瘤转移。孙小英等［18］研究显示，舌鳞状细胞癌组织中CXCR4 蛋白表达高于癌旁组织，上调CXCR4 表达可增强舌鳞状细胞癌细胞Tca8113 的增殖、侵袭和迁移能力。为了进一步探讨茯苓酸发挥抗舌鳞状细胞癌的作用机制，本研究首先检测了茯苓酸对CAL⁃27 细胞中CXCR4 蛋白表达的影响，结果显示，茯苓酸可降低CAL⁃27 细胞中CXCR4 蛋白表达，而过表达CAL⁃27 细胞中CXCR4 后，茯苓酸对CAL⁃27 细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响降低，提示茯苓酸通过下调CAL⁃27 细胞中CXCR4 表达发挥抗舌鳞状细胞癌作用。

综上所述，茯苓酸可抑制舌鳞状细胞癌细胞CAL⁃27 增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期进程，其作用机制与下调细胞中CXCR4 表达有关。本研究尚存在不足之处，仅在细胞层面初步探讨了茯苓酸对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，接下来本研究将通过动物模型实验进一步探讨茯苓酸对舌鳞状细胞癌肿瘤生长的影响及作用机制。