云南松松塔对LPS 诱导急性肺损伤大鼠炎症和氧化应激的影响

邓 多，谭会玲，上官云兰，吴道勋，耿 玲，刘光明，陈俊雅*

（1.大理大学药学院，云南 大理671000； 2.滇西应用技术大学，云南 大理671006； 3.大理大学基础医学院，云南 大理 671000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是肺炎、败血症、呼吸道细菌或病毒感染等多种因素引起的危重症常见的严重肺部并发症［1］，其特征主要是中性粒细胞内流，肺泡毛细血管屏障损伤导致间质性水肿，呼吸功能受损［2］，严重者会导致多器官功能衰竭而死亡。目前，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS⁃CoV⁃2）引发的2019 新型冠状病毒肺炎（COVID⁃19）依然在全球蔓延，造成许多患者出现严重肺炎和急性肺损伤，在COVID⁃19 中严重呼吸系统疾病可发展为急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍综合征［3］。虽然目前有关ALI 病理生理学方面的研究已有了很大进展，但尚无特效药物，仍然是危重病人发病和死亡的主要原因。

研究表明，松科松属植物云南松Pinus yunnanensisFranch.的球果松塔乙醇提取物具有抗肿瘤［4⁃5］、抗氧化［6］等多种药理活性，能明显抑制肺纤维化动物模型炎症因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF⁃α）、白介素1β（interleukin 1β，IL⁃1β）、白介素6（interleukin 6，IL⁃6）和干扰素γ（interferon gamma，IFN⁃γ）释放，但未见其对急性肺损伤的深入研究。因此，本实验在前期建立云南松松塔对肺纤维化动物模型的基础上，通过考察云南松松塔对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI 大鼠的影响，进一步明确该药材对肺部疾病的治疗作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD 大鼠，雌雄各半，体质量180～200 g，购自湖南斯莱克景达有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2016⁃0004，给药前适应性喂养1 周，自由饮水进食。

1.2 试剂与药物 云南松松塔采自云南省大理州大理市下关镇苍山东坡，经大理大学药学院刘光明教授鉴定为云南松Pinus yunnanensisFranch.的松果，即松塔，自然晾干后粉碎，95% 乙醇浸泡3 次，1%氢氧化钠提取，滤过，滤液分别用1、2、5倍量95%乙醇沉淀，合并沉淀物，减压干燥，得到云南松松塔提取物。脂多糖（LPS）（批号042619190814，上海碧云天生物技术有限公司）；醋酸地塞米松片（批号170108，浙江仙琚制药股份有限公司）。酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（大鼠IL⁃6，批号20 190524；大鼠TNF⁃α，批号20 190902；大鼠TGF⁃β1，批 号20 190902；大 鼠IL⁃10，批 号20 190902；大鼠IL⁃1β，批号20190920）均购自深圳索莱宝科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）测试盒（批号20190820）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（批 号20190829）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（批号20190827）、过氧化氢酶（catalase，CAT）测试盒（批号20190829）均购自南京建成生物工程研究所；TrizolTMRegent、cDNA 第一链合成试剂盒、Power UpTMGreen Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RT⁃PCR 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 仪器 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；酶标仪（美国Gene 公司）；8 道分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；核酸蛋白测定仪（美国Thermo fisher 科技公司）；PCR 仪（德国Biometra 公司）；电泳系统（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 分组与给药 将大鼠随机分为空白组，模型组，阳性组及云南松松塔提取物低、中、高剂量组，每组8 只，阳性组灌胃给予1.5 mg／kg 地塞米松，云南松松塔低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予50、100、200 mg／kg 相应提取物，空白组、模型组大鼠灌胃给予等容量生理盐水，连续4 d。第4 天给药后1 h 除空白组外，其余各组大鼠均腹腔注射LPS（10 mg／kg）诱导急性肺损伤［7］，4 h 后处死，收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、肺脏，计算脏器指数，公式为脏器指数＝脏器质量／体质量。

2.2 支气管肺泡灌洗液制备 实验结束后处死大鼠，打开胸腔，左肺上叶结扎，摘取支气管，用5 mL生理盐水冲洗，收集冲洗液，3 000 r／min 离心10 min，收集上清，在－80 ℃下保存，即为支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。

2.3 组织学评价 剪取结扎大鼠左肺，固定于4%多聚甲醛溶液中，脱水后石蜡包埋，5 μm 切片，苏木素⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色，观察肺泡壁及支气管壁厚度、炎性细胞浸润情况、充血水肿情况。

2.4 BALF 中氧化因子水平检测 取大鼠BALF，按照试剂盒说明书检测SOD、MDA、NO、CAT 水平。

2.5 BALF 中炎症因子水平检测 取上清、不同质量浓度对照品及其稀释液各100 μL，加入预包被单克隆抗体的96 孔板中，洗板，加入100 μL 生物素化抗体孵育1 h，洗板，加入辣根过氧化物酶并避光孵育30 min，洗板，加入100 μL 酶结合物抗体，孵育15 min 后加入终止液，用酶标仪在450 nm波长处测量3 次。采用酶联免疫吸附试剂盒，检 测BALF 中TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、IL⁃10、TGF⁃β1 水平。

2.6 TLR4／NF⁃κB 信号通路因子的mRNA 相对表达检测 取20 mg 大鼠肺组织，按照Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，利用NanoDrop One spectrophotometer、1%琼脂糖凝胶精确测定RNA 浓度和确定完整性，当A260／A280在1.8～2.0 范围内时，可用于后续的cDNA 分析。取500 ng 总RNA，按照试剂盒说明书合成第一链cDNA，Toll 样因子4（TLR4）、核因子κB（NF⁃κB）、IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α的相对基因表达通过PCR 进行评价。通过逆转录反应获得的cDNA 稀释8 倍，并进行RT⁃PCR 分析，条件设定为95 ℃变性30 s，95 ℃变性10 s，40 个循环，60 ℃变性30 s，最后运行溶解曲线。以 GAPDH（glyceraldehyde 3⁃phosphate dehydrogenase）为内参，特异性引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，结果采用2－ΔΔCT法进行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 统计学分析 通过GraphPad Prism 6 软件进行处理，结果以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），组间两两比较采用SNK⁃q 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 脏器指数 与正常组比较，模型组大鼠肺脏指数、脾脏指数、肝脏指数、肾脏指数升高（P＜0.05，P＜0.01），胸腺指数降低（P＜0.01），心脏指数无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，云南松松塔高剂量组大鼠肺脏指数、脾脏指数、肝脏指数降低（P＜0.01），胸腺指数升高（P＜0.01）肾脏指数、心脏指数无明显变化（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠脏器指数（， n＝8）Tab.2 Organs indices of rats in various groups（， n＝8）

表2 各组大鼠脏器指数（， n＝8）Tab.2 Organs indices of rats in various groups（， n＝8）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 组织病理学变化 与正常组比较，模型组大鼠肺组织肺泡壁、支气管壁中有大量炎症细胞积聚，肺泡隔膜水肿变厚，导致肺泡空间急剧减少和间质充血；云南松松塔高剂量组明显减轻了LPS诱导的大鼠ALI 组织损伤，包括水肿、充血、炎症等，见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理学变化（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of rat lung tissues in various groups（HE，×200）

3.3 抗炎能力 与正常组比较，模型组大鼠BALF 中TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、TGF⁃β 水平升 高（P＜0.01），IL⁃10 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性组、云南松松塔高剂量组大鼠BALF 中TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、TGF⁃β 水平降 低（P＜0.01），IL⁃10 水平升高（P＜0.01），见表3。

表3 各组大鼠BALF 中炎性因子水平（， n＝8）Tab.3 Levels of inflammatory factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

表3 各组大鼠BALF 中炎性因子水平（， n＝8）Tab.3 Levels of inflammatory factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 抗氧化能力 与正常组比较，模型组大鼠BALF 中SOD、CAT 水平降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，云南松松塔高剂量组大鼠BALF 中SOD 水平升高（P＜0.01），MDA、NO 水平降低（P＜0.01），见表4。

表4 各组大鼠BALF 中氧化／抗氧化因子水平（， n＝8）Tab.4 Levels of oxidative／anti⁃oxidative factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

表4 各组大鼠BALF 中氧化／抗氧化因子水平（， n＝8）Tab.4 Levels of oxidative／anti⁃oxidative factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 肺组织mRNA 相对表达 与正常组比较，其余各组大鼠肺组织中TLR4、NF⁃κB、TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β相 对mRNA 表达升 高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，阳性组、云南松松塔高、中剂量组大鼠肺组织中TLR4、NF⁃κB、TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β相对mRNA 表达降低（P＜0.01），见图2。

图2 各组大鼠肺组织中TLR4、 NF⁃κB、 TNF⁃α、 IL⁃6、 IL⁃1β 相对mRNA 表达（， n＝8）Fig.2 Relative mRNA expressions of TLR4， NF⁃κB， TNF⁃α， IL⁃6 and IL⁃1β in lung tissues of rats in various groups（， n＝8）

4 讨论

ALI 是一种严重的呼吸系统疾病，是急性和持续性肺部炎症的基础，可由败血症、肺创伤、烧伤等多种因素引起［8］。在ALI 起始和发展阶段，中性粒细胞和淋巴细胞招募发挥重要作用［9］。在本研究中，给予ALI 大鼠云南松松塔提取物预处理后，其肺泡壁和支气管壁中的炎症细胞大量减少，肺泡隔膜水肿减轻，间质充血得到改善。

LPS 是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，也是重要的炎症诱导剂［10］。LPS 诱导的ALI 与NF⁃κB 通路有关［11］。在ALI 中，LPS 被TLR4 识别，从而激活NF⁃κB［12］，诱导多种促炎因子的释放，包括TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 等［13］，引发炎症反应和进一步的组织损伤。而TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 的产生，会引起NF⁃κB 的持续激活，从而诱导持续的炎症反应［14］。因此，抑制TLR4／NF⁃κB 信号通路的激活能够改善ALI 炎症状态［15］。RT⁃PCR 结果表明，PE 能够下调TLR4、NF⁃κB的mRNA 相对表达，从转录水平下调炎症因子TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的mRNA 相对表达，从而减少BALF 中促炎细胞因子TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 的释放，减轻LPS 诱导的ALI 大鼠炎症水平。

除了炎症反应外，氧化应激在LPS 诱导的肺损伤病理过程中也发挥重要作用［16］。急性肺损伤发生后，受损细胞释放大量氧自由基，如NO 等而引发脂质过氧化，从而使生物膜通透性增加，稳定性变差［17］。此外，脂质过氧化终产物MDA 与氨基酸、蛋白质、核酸等生物分子结合会造成这些生物分子失活而产生毒性［18］。因此，提高机体内抗氧化酶如SOD、CAT 活力，降低氧化酶和氧化产物如NO、MDA 等的量则能够抑制氧化应激，改善急性肺损伤。在LPS 诱导的大鼠ALI 中，云南松松塔提取物显著增强了ALI 大鼠抗氧化酶SOD 的活力，并降低MDA 和NO 水平。

综上，云南松松塔提取物能通过抑制TLR4／NF⁃κB 炎症信号通路和氧化应激，下调促炎基因TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 的相对mRNA 表达，而减少炎症因子分泌，抑制ROS，增强抗氧化酶活性，从而保护LPS 诱导的大鼠ALI。当然，本研究仍然存在一定的局限性。目前研究发现云南松松塔提取物能够从转录水平调节炎症，但是否能够从翻译水平改善ALI 动物炎症水平，以及云南松松塔提取物如何调节氧化应激和炎症信号通路，以及云南松松塔提取物能否预防急性肺损伤后的并发症，需要我们进一步进行深入研究，从而为云南松松塔的进一步应用提供理论和实验依据。