群体感应抑制剂调控食源性微生物生物膜形成的研究进展

莫祯妮，熊盈盈，邱树毅，曾祥勇,*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省发酵与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

食品的腐败变质是由于腐败或致病微生物的生长和繁殖引起的，生产、加工、运输、销售和贮藏等过程都有可能引起腐败或致病微生物的生长，形成相应的生物膜。生物膜是指细菌附着在固体表面上，产生细胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）基质，并将原核微生物和/或真核微生物嵌入其中，形成具有空间组织的群落[1]。生物膜的基本骨架是由多种EPS组成的三维结构，对细菌在固体表面黏附以及细胞内的聚集起关键作用[2]。生物膜可以保护内部病原菌细胞，有助于营养物质的补充，因此生物膜黏附在生物或非生物表面会导致食源性疾病的风险增加，且难以被清洁剂和消毒剂清除，从而影响食品安全[1]。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报道，每年由病原菌引起的食源性疾病占比高达30%，其中有65%都是因为病原菌形成生物膜造成的[3]。因此，在食品加工生产过程中控制生物膜形成已成为当今亟需解决的一个重要问题。

群体感应（quorum sensing，QS）是细胞-细胞的交流机制，是细菌进行种间或种内信息交流的一种信号转导机制，当群体密度达到一定阈值时，能够自发产生、释放一些信号分子，细胞受体识别信号，可调控基因表达，并参与许多重要的生物学过程，如孢子形成、毒力和发病机制、食物腐败和生物膜形成等[4]。细菌从游离状态到形成成熟的生物膜的过程中，主要是通过QS系统和一系列的环境信号调节表达。QS现象与生物膜形成有着至关重要的关系，当环境条件不利于细菌生长时，细菌在QS系统的调控下聚集，形成生物膜，若缺失QS系统，形成的生物膜会变得稀薄。QS系统不仅可以影响细菌的聚集，还会影响细菌的黏附性、疏水性、EPS的含量等。同时，生物膜的形成也可以影响QS信号分子的扩散[5]。

生物膜是食品工业中最常见的污染形式，在食品加工中形成生物膜，会降低食品加工过程的有效性，影响食品品质和安全，从而导致细菌食源性疾病的风险增加。因此抑制生物膜的形成和去除生物膜具有重要意义。近年来研究发现大多数细菌生物膜的形成都依赖于QS系统的调控[6]，所以，通过抑制QS系统调节生物膜的形成已成为一项有效的控制策略[7]。

1 生物膜的形成

生物膜的形成是一个复杂的动态过程，该过程中涉及到细胞表面分子、毒力因子等多方面的变化，最终达到促进细菌在不利环境中生长的目的。食品中多种微生物（包括导致腐败和致病的微生物）都可以形成生物膜，并在许多感染中发挥关键作用[8]。生物膜的形成一般分为5 个阶段[8-9]（图1）：1）可逆黏附阶段。在环境中浮游的细菌会通过物理作用（如范德华力、静电相互作用）或借助鞭毛、菌毛的运动黏附在物体表面，这一阶段是形成生物膜的关键，附着的微生物起初只有少量EPS，不具有分化能力，可能会从表面脱落重新回到浮游状态，因此这个阶段是可逆的[10]。黏附物的表面性质如粗糙度、表面电荷、疏水性等在细菌黏附中起重要作用[11]。塑料、玻璃、金属、木材和食品等疏水性表面更容易形成生物膜[12]。2）不可逆黏附阶段。细菌在生物或非生物表面进行最初的可逆黏附后，附着的细胞开始分泌群体感应分子（quorum sensing molecules，QSMs）和EPS，从而提供较强的附着能力，导致不可逆黏附。此时生物膜变得难以去除，需要酶、表面活性剂、消毒剂和/或热量对附着力进行强剪切或化学反应才能破坏。3）微菌落形成阶段。当细菌附着在生物或非生物表面时，可以通过QS机制相互交流并分泌EPS，在EPS内繁殖形成微菌落，这有助于加强细菌与基质之间的联系，并在环境中稳定菌落，该过程需要如鞭毛、菌毛、QSMs和EPS的共同参与。4）成熟阶段。此阶段是最稳定的，形成了成熟的生物膜，附着的菌群以单层或多层的聚集体存在，菌群具有不同的形状，如蘑菇状等，细胞外基质可以保护细胞免受外部损伤。在生物膜成熟阶段中，QS系统会调节EPS中某些重要基因的表达，表明QSMs是参与生物膜形成的重要调控机制[13]。5）分散阶段。此阶段生物膜内的细菌开始凋亡，当受到外部因素如流体剪切力增加，内部因素如内源性酶降解、EPS或表面结合蛋白的释放影响时，活的细菌又可以分散到周围环境中，这些浮游态细菌再次附着在表面形成新生物膜，重复以上这些过程。

图1 生物膜形成阶段假想模型[8-9]Fig.1 Hypothetical model of biofilm formation stages[8-9]

2 QS调控生物膜形成

2.1 QS系统的分类

QS是基于细胞外化学信号分子的产生、释放和控制来调整自身群体密度和行为的过程，细菌在生长和繁殖过程中向周围环境分泌特定的信号分子，这种信号分子被称为自诱导物（autoinducer，AI）[4]。QS信号分子可分为3大类：N-酰化高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）、自诱导寡肽（autoinducing peptide，AIP）和自诱导子-2（autoinducer-2，AI-2）。当这些信号分子浓度达到一定阈值时，细菌群体会通过特异性靶基因的协同表达来响应[14-15]。

2.1.1 AHLs介导的革兰氏阴性菌QS系统

大多数革兰氏阴性菌（G-）的QS系统都是以AHLs信号分子介导的。AHLs是以N-酰基高丝氨酸内酯环为核心的，酰基链通常含有4～18 个碳。高丝氨酸内酯环部分来源于S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），酰基侧链部分来源于酰基载体蛋白或酰基辅酶A[16]。luxI/luxR系统是G-中典型的QS调控系统。LuxI同源蛋白合成酶产生的AHLs作为AI，然后分泌到细胞膜外，当达到阈值浓度时与LuxR家族的受体蛋白相互作用，导致靶基因的抑制或激活[17]。

2.1.2 AIP介导的革兰氏阳性菌QS系统

在革兰氏阳性菌（G+）中，AIP信号分子是一种特有的经过翻译、修饰后形成的具有稳定性的自诱导肽，AIPs必须通过ATP-结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运系统或其他膜蛋白才能分泌到胞外。AIP与由膜结合的传感器激酶受体和细胞质转录因子组成的双组分系统来调节基因表达[16]。当AIP累积到一定浓度阈值时，双组分系统的感应识别元件识别到AIP，AIP被磷酸激酶受体识别，激酶中的组氨酸残基磷酸化，将磷酸化信号传导到与之对应的转录调节蛋白的天冬氨酸残基后，最终磷酸化的反应调节蛋白与DNA特定位点结合，进而调控QS相关基因的表达，形成动态的交流系统[4]。

2.1.3 AI-2介导的QS系统

AI-2信号系统是在G+和G-中共同存在的一种QS系统，既可用于细菌种内也可用于种间的通讯。AI-2与生物膜形成、细胞运动、结合和毒力因子产生等细菌表型有关[18]，是由LuxS酶在活化甲基循环中合成的4,5-二羟基-2,3-戊二酮衍生的一系列相互转化化合物[19]。在该系统中，LuxS蛋白酶调控AI-2的合成，随着细胞的分裂和增殖，转运到胞外的AI-2浓度增加，达到某一阈值时会与LuxP受体蛋白结合，从而调节包括生物膜形成的QS基因表达[20]。

2.2 QS在生物膜形成中的调控作用

生物膜的形成通常通过细胞间的交流或QS来协调[1]。当细菌受到不利外界条件胁迫后，会激发细胞的环境信号应答系统，激活细胞内基因表达或改变调控元件转录，从而调节EPS（多糖基质、纤维蛋白等）的合成与释放，细菌黏附性发生改变，进而影响生物膜成熟与结构。当黏附细胞达到一定数量时产生信号分子，信号分子浓度积累到阈值时，引起细胞内蛋白质的转录和表达，形成生物膜[21-22]。

Davies等[23]描述了lasQS系统在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中形成生物膜的作用，首次研究了QS与生物膜的关系。P.aeruginosa的lasI缺陷型突变株形成未成熟的生物膜，在添加信号分子3OC12-HSL后，又能重新形成成熟的生物膜[23]。在P.aeruginosa中已知两套QS调控系统——lasI/lasR、rhlI/rhlR，lasQS系统决定了细菌生物膜的差异性，LasI合酶催化产生的3-oxo-C12-HSL信号分子，可以调控细菌的黏附、游动和细菌生物膜的形成，激活lasI、lasB、lasA、toxA基因的表达；而rhl系统可以通过调节鼠李糖脂产量维持细菌生物膜的基本结构[24]。研究表明，AHLs介导的QS系统使P.aeruginosaPAO1菌株形成的生物膜释放eDNA和PA14菌株产生EPS[25]。随后，研究人员在P.aeruginosa中又发现了第3套QS调控系统——喹诺酮类假单胞菌信号（Pseudomonasquinolone signal，PQS）系统，该系统以2-烷基-4-喹诺酮（2-alkyl-4-quinolone，AQ）作为信号分子，主要包括2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮和2-庚基-4-羟基喹啉（2-heptyl-4-quinolone，HHQ），PQS的合成由pqsABCDE操纵子和两个独立转录单元pqsH和pqsL负责[26]。PQS突变菌株会抑制生物膜的形成，降低藻酸盐、鼠李糖脂等的产量，使生物膜结构变得松散，外源添加信号分子后，可以正常形成生物膜，所以PQS系统对生物膜形成具有重要作用[27]。PQS系统还可以控制eDNA的释放，可能是因为PQS系统正向调控绿脓菌素的产生，从而诱导H2O2介导的细胞裂解来促进P.aeruginosa中eDNA的释放[28]。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病微生物，是G+的代表微生物，它会导致肺炎、心内膜炎、伤口感染和其他并发症。S.aureus的QS系统是由信号分子AIP介导的附属基因调节因子（accessory gene regulator，Agr）系统，生物膜的形成及毒力因子的产生受此调控。该系统中的agr基因由两个转录单元RNA II和RNA III组成，分别从P2和P3启动子上启动转录。P2驱动的操纵子包含agrBDCA基因，前体肽agrD经调控蛋白agrB和蛋白酶加工合成AIP，agrC和agrA编码的转膜受体组氨酸激酶AgrC和细胞质调控子AgrA组成双组分传导系统，AIP与组氨酸激酶AgrC结合后使AgrA发生磷酸化，通过结合同源DNA序列来调控转录重组，导致基因表达的上调或抑制[29]。磷酸化的AgrA还能够调节由P3启动子驱动的RNA III的表达，RNA III是一种参与α-溶血素等外毒素上调的多效性效应因子，而RNA III转录是由P3启动子驱动的，能使编码生物被膜形成必需基因黏附素的表达下调，并诱导荚膜、毒素以及蛋白酶的产生[30]。RNA III进一步与其靶蛋白TRAP结合，促进S.aureus生物膜生成[31]。AIP和调节效应器RNA III生成能力缺失影响S.aureus的生物膜形成[32]。酚溶性调节蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）是具有α-螺旋两亲性结构的葡萄球菌肽，具有表面活性剂的特性，是S.aureus形成生物膜的关键结构因子，AgrA反应调节蛋白控制着psm操纵子的转录，psm基因的表达促进生物膜的形成，阴碍生物膜分散和再生等过程[32]，而MgrA是psm的负调控因子，通过结合psm启动子区域抑制psm在S.aureus生物膜中的转录，从而负向调节生物膜的形成和脱落[33]。

3 QS抑制剂的调节机制及分类

3.1 QS抑制剂的调节机制

生物膜的形成会给食品行业带来巨大的挑战。一旦形成生物膜就难以去除，在生物膜内部，细菌可以免受环境压力的影响，如对抗生素、消毒剂和高温等均有耐受性[34]。因此，研究控制生物膜的策略对于食品安全显得极为重要。QS抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSIs）是一类以QS系统为靶标，干扰细菌生物被膜形成、毒力因子的产生或致病基因表达的物质，被认为是一种抑制生物膜形成的有效方法，通过抑制QS特定基因的表达阴止细胞间通讯，而不是像传统的消毒剂那样杀死细菌。因此，开发新型QSIs成为了当前研究的热点。据目前报道，QSIs可以通过不同机制调控生物膜的形成，主要包括抑制信号分子合成、酶解信号分子和QS类似物竞争性结合受体蛋白3 种方式。

3.1.1 抑制信号分子合成

QS信号分子主要是底物经过酶的催化合成，因此为了阴断信号分子的合成，可以通过抑制酶的活性或破坏底物。Chang等[35]测定了水杨酸、单宁酸、反式肉桂醛在0.3 mg/mL时对AHL信号分子产生的效果，结果表明水杨酸只能减少并不能完全抑制信号分子的产生，单宁酸和反式肉桂醛能够抑制AHL合酶（RhlI）的产生，但不能抑制AHL合酶（LasI）的产生，两者均对P.aeruginosa没有抑菌作用，进一步对反式肉桂醛研究发现，其可以与LasI和RhlI的底物结合位点相互作用，抑制铜绿假单胞菌QS系统关键下游基因lasB、rhlA和pqsA的表达，从而影响生物膜形成。Li Tingting等[36]的研究发现0.5 μL/mL邻氨基苯甲酸甲酯可以通过干扰AHL的生物合成以及与受体蛋白的竞争性结合来抑制温和气单胞菌（Aeromonas aeruginosa）的QS系统，显著减少了生物膜的形成。Lou Zaixiang等[37]通过研究发现，2 mg/mL牛蒡叶提取物不仅能够完全抑制生物膜的形成，还能抑制信号分子3-oxo-C12-HSL的产生，从而干扰了AHL的合成。有研究发现一种真菌的次级代谢产物——Ambuic Acid，能够通过抑制AgrB合酶活性来干扰G+AIP的生物合成[38]。另外，芦丁[39]、柠檬醛[40]等能够减少AI-2的合成，从而抑制生物膜的形成。

3.1.2 酶解信号分子

在信号分子合成后，还可以使用降解酶水解信号分子，使其在细胞外无法达到临界阈值浓度，QS系统无法感知信号分子，从而阴止QS系统调控细菌表型。能降解QS信号分子的酶称为群体猝灭酶（quorum quenching，QQ）。目前研究较多的是AHL降解酶，AHL降解有4 种方式：AHL内酯酶和AHL酰基酶分别水解AHL的高丝氨酸内酯环和酰胺键，AHL氧化酶和AHL还原酶不会降解AHL分子，但会修饰AHL分子并改变其活性[41]。Vinoj等[42]发现由地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DAHB1表达的AHL内酯酶（AiiA）具有广谱AHL底物特异性。纯化的重组AiiA能够降解产生的C6-HSL，也能抑制弧菌属（Vibriospp.）生物膜的发育，并显著降低循环水产养殖系统中虾的感染和死亡率。Zhang Bao等[43]发现芽孢杆菌（Bacillus）QSI-1中的AHL内酯酶基因aiiA，并将其在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表达。研究发现，aiiAQSI-1基因能够降解嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的C6-HSL信号分子，导致细菌游动能力下降，胞外蛋白酶和溶血素毒力因子含量减少，并抑制了A.hydrophilaYJ-1的生物膜形成。同时，Zhang Bao等[43]在饲料中添加AiiAQSI-1蛋白，喂养鲫鱼96 h后发现没有死亡现象，表明添加AiiAQSI-1蛋白对鱼的生存不具有毒性，故可在饲料中添加该蛋白通过群体猝灭控制嗜水气单胞菌病。

3.1.3 QS类似物竞争性结合受体蛋白

大多数的研究都集中于开发天然AHL信号分子的类似物，主要是修饰AHL的酰基侧链或内酯部分，只有少数研究关注中心酰胺部分的改变，Brackman等[44]合成了酰胺功能被三唑取代的AHL类似物，在此研究中所合成的所有化合物都能够阴断QS中的C6-HSL，主要是通过苯基化合物改变酰基侧链，活性最强的QSI对P.aeruginosa生物膜表现出较强的抑制和清除活性。另外，研究人员对AIP类似物、4,5-二羟基-2,3-戊二酮类似物也有所研究[41]。这些类似物能够竞争性地与特异性受体蛋白的活性位点进行结合，从而阴断微生物的QS系统。Cheoljin等[45]合成了11 种QS拮抗剂，发现10 种新的AHLs类似物或N-磺酰高丝氨酸内酯衍生物被证明可以作为N-(3-氧辛烷酰基)-L-高丝氨酸内酯的拮抗剂。通过分子模拟实验后，发现疏水相互作用是一个重要的影响因素。Qin Xiaofei等[46]合成了4 种与高丝氨酸γ-内酯结构类似的化合物，并将其命名为TGK系列化合物。TGK系列化合物与TraR蛋白（LuxR的替代物）的结合能力比与天然底物N-(3-氧代辛烷酰基)-L-高丝氨酸内酯（OOHL）的结合能力更强，同时还发现其与TraR蛋白形成了比3o-C6-HSL更强的疏水相互作用，从而为合成的TGK系列化合物提高群体猝灭活性提供了理论依据。姜辣素是从生姜中提取出的辛辣油，是AHL的结构类似物，Parmar等[47]的研究表明姜辣素是通过氢键和疏水相互作用与LuxR发生拮抗作用，与LuxR的自发结合可能改变LuxR的构象，使其不能转录激活lux操纵子。

3.2 QSIs的分类

3.2.1 天然QSIs

近十几年来，研究发现许多天然产品，如食用和药用植物的精油、草药、香料及其分离成分，在抑制生物膜的形成方面具有相当大的潜力，甚至能够破坏食品工业中已经形成的生物膜，可作为QSIs调控生物膜的形成。

3.2.1.1 植物源QSIs

目前，植物源的QSIs研究最为广泛，植物产生的次生代谢产物会抑制细菌产生致病性的毒素，抑制其生物膜的形成，具有干扰QS的作用，抗菌活性成分主要是酚类、黄酮、醌类、香豆素等。

精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中，通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶剂提取法提炼萃取的挥发性芳香物质。Myszka等[48]研究发现百里香精油在剂量为10 μL/mL时抑制了紫罗兰素的产生，降低了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物膜的黏附性，有效地抑制了P.fluorescens内AHLs的产生，并能显著抑制细菌的运动，降低鞭毛基因的mRNA水平。Luciardi等[49]用气相色谱-质谱分析发现葡萄柚精油中主要含有萜类物质，可以抑制P.aeruginosa中AHLs的产生，进而抑制生物膜的形成，且高质量浓度（4 mg/mL）的葡萄柚精油比低质量浓度（0.1 mg/mL）精油能够更好地抑制生物膜的形成。L-香芹酮是留兰香精油的主要成分，Li Tingting等[50]的研究揭示了L-香芹酮在0.5 μL/mL时对生物膜的形成有最好的抑制效果，抑制率达到了52.41%，通过气相色谱-质谱分析，L-香芹酮能够显著抑制哈维氏弧菌（Vibrio Harvei）AHL（C6-HSL和C8-HSL）的产生。此外，在对AHL合酶HalI和QS转录调节因子HalR的计算机分析和实时荧光定量聚合酶链式反应的研究中发现L-香芹酮是通过氢键与AHL合酶HalI结合，导致AHL生物合成的中断。

在香料中也发现了能够有效抑制生物膜的天然物质，如肉桂醛、姜黄素等。Nakagawa等[51]研究发现迷迭香叶中的肉桂酸和肉桂醇是金黄色葡萄球菌agr表达的一种特异性抑制剂，能够有效抑制S.aureus中的RNA III和psma基因表达。Li Tingting等[52]研究发现肉桂醛在0.025 μg/mL时就能够抑制P.fluorescens生物膜的形成。具体来说，肉桂醛通过氢键作用与P.fluorescens的LuxR型蛋白竞争性结合，进一步研究发现其是通过阴止AHLs与其受体蛋白结合，而不是通过抑制AHLs的产生来调节或抑制QS，可能是通过氢键作用与P.fluorescens的LuxR型蛋白结合，起到竞争作用，使导致P.fluorescens的QS系统受到抑制。由于肉桂醛具有良好的安全性，所以它是一种具有发展前景的QSIs，在水产品保鲜方面的应用具有很大的潜力，以保证食品安全。Srinivasan等[53]研究发现胡椒乙酸乙酯提取物中主要存在的十六烷酸，可以有效地抑制V.harvei的黏附和微菌落的形成，进而阴碍生物膜的形成，十六烷酸对V.harvei的最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为1 600 μg/mL，在亚抑菌质量浓度为400 μg/mL时，对QS介导的生物发光生成和生物膜形成的抑制率分别高达98%和74%。在Shukla等[54]的研究中，姜黄素质量浓度在3 µg/mL时，P.aeruginosa形成的生物膜显著减少，姜黄素与AHL受体的自发结合可能改变其构象，使其不能转录激活一系列基因，因此，姜黄素是一类有效的QSIs。

在一些蔬菜、谷物中，研究人员发现大麦芽碱、玉米黄质等物质能抑制生物膜形成。Gökalsın等[55]的研究表明玉米黄质在12 μmol/L浓度下即能抑制P.aeruginosaQS系统，是比地衣次生代谢物Everonic Acid更好的抑制剂，对las和rhlQS系统均表现出显著的QS抑制作用。Zhou Jinwei等[56]首次发现发芽大麦中的大麦芽碱能够抑制P.aeruginosa的QS，在0.5～1.0 mg/mL质量浓度范围内，显著抑制AHL的合成，QS相关基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的表达被显著抑制。Ouyang等[57]研究发现16 mg/mL的槲皮素就能显著抑制P.aeruginosa中lasI、lasR、rhlI和rhlR的基因表达。QS在调节生物膜形成和毒力因子产生起着重要作用，因此，槲皮素抑制生物膜形成和毒力因子的产生是通过对QS的影响实现的。

不仅是陆生植物，在海洋植物中也发现了如呋喃酮类等化合物可以抑制生物膜的形成。Koh等[58]研究了从澳大利亚海藻Delisea pulchra中分离到的呋喃酮类物质，能有效抑制AHL信号分子产生的化合物。呋喃酮类化合物与LuxR型蛋白竞争性结合，从而阴止QS系统的形成，导致无法形成生物膜。Karnjana等[59-60]曾发现红藻中的乙醇提取物能够抑制V.harvei生物膜的形成，进一步分离乙醇提取物得到两种名为N-苄基肉桂酰胺和α-间苯二甲酸的化合物，体外活性测定表明两种化合物均能抑制生物膜的形成，且N-苄基肉桂酰胺比α-间苯二甲酸更为有效。

3.2.1.2 动物源QSIs

不仅在植物中具有抑制QS的抗菌活性成分，在一些动物体内也发现了QS猝灭酶，这可能是动物体对抗其寄生性致病菌的一种防御机制。Dong Yihu等[61]的实验证明猪肾脏酰基转移酶I能够灭活QS信号分子C6-HSL和3o-C12-HSL，但是不能灭活C4-HSL信号分子。Pejin等[62-63]首次在体外研究了两种淡水苔藓虫——斑点透明虫Hyalinella punctata和金丝桃虫Pectinatella magnifica对P.aeruginosaPAO1的抗QS活性，发现生物乙醇提取液对生物膜的形成有显著影响；在用0.015 mg/mL和0.03 mg/mL乙醇溶液提取时，生物膜形成量分别减少了59.14%和54.82%。Vadassery等[64]从尼罗河罗非鱼胃肠道中分离出AHL降解菌——粪肠球菌（Enterococcus faecalis）QQ12，其在体外能快速降解合成的C6-HSL，对A.hydrophila产生的AHL具有良好的降解能力，能够很好地抑制A.hydrophila毒力因子。孙梦桐等[65]筛选了来源于鱼类肠道中的乳酸菌，研究其对V.harveiQS系统及生物膜形成的抑制作用，其中抑制效果最好的是来自鲤鱼肠道的菌株LY3-1，当乳酸菌菌液粗提物质量浓度为16 mg/mL时，可完全降解AHLs信号分子，生物膜抑制率达90.6%。Meto等[66]的研究发现蜂交也具有干扰QS系统的活性，分别用乙醇、丙二醇、聚乙二醇400对蜂交进行提取，并用高效液相色谱-电喷雾质谱联用对所提取的多酚类化合物进行了鉴定。乙醇提取物在抑制微生物生长和生物膜形成方面最有效，其次是丙二醇和聚乙二醇400蜂交提取物。蜂交中的多酚类乙醇提取物中会导致P.aeruginosa中eDNA的释放和吩嗪的生成减少。

3.2.1.3 微生物源QSIs

微生物来源的QSIs主要是在细菌、真菌中，其中来源于放线菌的较少。微生物的培养具有高效性，对QSIs的开发具有重要意义。微生物在自然环境中长期进化，与其他生物存在竞争关系，为了生存可能会产生QSIs抑制其他竞争性细菌的QS系统。

Rasmussen等[67]在33 种青霉菌属Penicillium中发现了QSIs——棒曲霉素或青霉酸，其可干扰P.aeruginosa的RhlR和LasR受体蛋白。Li Rui等[68]研究发现类杆菌素作为一种天然抗菌肽，在亚抑菌质量浓度1.7 mg/mL下显著降低了单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）prfA和flgE的表达，通过抑制生物膜相关基因（prfA、agrA、flaA、fliG和flgE）的表达来抑制生物膜的形成。Parasuraman等[69]发现淡紫拟青霉海洋真菌（Pestalotiopsis sydowiana）提取物具有有效的抑菌性，该提取物在亚抑菌质量浓度250 μg/mL和500 μg/mL下，能使P.aeruginosaPAO1受QS调控的毒力表型如绿脓杆菌素、几丁质酶、蛋白酶等的产量有所减少。此外，还能降低胞外多糖、鼠李糖脂和海藻酸盐的产量，抑制细菌生物膜的形成。

内生真菌普遍存在于各种植物中，Prateeksha等[70]从地衣中分离得到内生真菌（endolichenic fungus，ELF），经过丙醇提取后在4 mg/mL质量浓度下对P.aeruginosaPAO1具有明显的抗QS活性，但不影响其细胞活力。ELF的代谢提取物中存在的棕榈酸和亚油酸可能对P.aeruginosaPAO1的毒力因子有抑制作用，对其生物膜形成也有一定的抑制作用。Mishra等[71]从番木瓜中分离到的内生真菌（Alternaria alternata），因其含有一种复合亚硫酸2-丙基十三酯，能对P.aeruginosaPAO1表现出QSI和生物膜结构的改变。还可以通过抑制褐藻酸盐、EPS的产生和eDNA的分泌，抑制了绿脓杆菌色素、弹性蛋白酶、蛋白酶、几丁质酶等多种致病性状，并减少了生物膜的形成。随后，Meena等[72]又研究了从番木瓜中分离的内生真菌Phomopsis Tersa对QS介导的P.aeruginosaPAO1致病性的抑制作用。结果表明，在亚MIC为900 μg/mL时，Phomopsis Tersa粗提物可使P.aeruginosaPAO1氧化还原活性色素绿青素和吡哆醇的生成量分别减少92.46%和71.55%。此外，粗提物还能抑制与生物膜形成有关的毒力因子胞外多糖和海藻酸盐的表达。

另外，Wang Mengjia等[73]从一株具有抗QS活性的海洋真菌Cladosporiumsp.Z148中分离到一种新型的QSIs Cladodionen，其可下调QS相关基因的mRNA表达，包括受体蛋白（lasR、rhlR和pqsR）、自身诱导合成酶（lasI、rhlI和pqsA）以及毒力因子（lasB和rhlA）的mRNA表达，抑制生物膜的形成。Younis等[74]从海洋沉积物和土壤样品中分离的嗜盐菌——海洋链霉菌，该海洋链霉菌的次生代谢产物可抑制奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）QS的产生。

3.2.2 人工合成的QSIs

近年来，人工合成的QSIs变得更加广泛，主要是对信号分子进行修饰、人工合成信号分子类似物、或者是对受体蛋白进行修饰，使信号分子不能与受体蛋白进行结合，从而不能形成QS。

呋喃酮是最常见的QSIs，人工合成的呋喃酮QSIs的研究最为广泛。邢家溧等[75]研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮对P.fluorescens的作用，在质量浓度为1 MIC（12.5 μg/mL）和5 MIC（800 μg/mL）时，对生物膜的抑制率分别为20.59%和99.54%，72 h的生物膜抑制率均高于24 h的抑制率，这就表明通过干扰其QS系统而影响细菌生物膜的形成，能够抑制P.fluorescens的群集运动能力，干扰其QS系统从而影响其总蛋白合成及多糖的含量，可为在食品中预防或抑制生物膜的形成提供参考。另一项研究发现，添加了呋喃酮C-30后，可以抑制变形链球菌（Streptococcus mutans）生物被膜的形成，使生物膜变薄甚至解体，这与C-30降低了QS调控基因的表达活性有关[76]。Yang Sijie等[77]设计了一个新的溴化呋喃酮类化合物（brominated furanones，BBFs），具有溴代基团的双环结构。所有的BBFs均能抑制P.aeruginosa毒力因子LasR的产生，其中6-BBF和7-BBF对lasIQS中的LasR蛋白酶有拮抗作用，而5-BBF对rhlIQS有促进作用，故BBFs的结构变化可以作为控制生物被膜形成的靶向功能。本研究还证明了与其他已知的溴化呋喃酮相比，BBFs对人体细胞的毒性更低，为探索低毒且高效抑制生物膜的化合物奠定了基础。

Kalaiarasan等[78]研究发现，N-[4-(4-氟苯胺)丁酰基]-L-高丝氨酸内酯和N-[4-(4-氯苯胺]丁酰基]-L-高丝氨酸内酯，可以下调QS基因的表达水平，与LasR以氢键结合，使lasQS系统表达显著降低，影响了生物膜形成。Sully等[79]通过高通量筛选，在多种化合物中发现一种能够抑制S.aureus产生毒力因子的QSIs——Savarin，阴碍了该菌的Agr QS系统，从而抑制其形成生物膜，减轻由S.aureus引起的感染。D’Almeida等[80]在合成香豆素及其羟基化衍生物抑制P.aeruginosa和紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）QS产生的研究中发现，芳香环上带有羟基官能团的香豆素比C3、C4上有取代基或者在吡喃酮环C3、C4上没有双键的香豆素能更好地抑制P.aeruginosa生物膜形成，吡喃酮环C3上的羟基在抑制紫色杆菌的群体感应和铜绿假单胞菌的弹性蛋白水解酶活性方面非常重要。Valliammai等[81]证实了5-十二烷醇（5-dodecanolide，DD）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的非抗菌生物膜抑制作用。DD处理显著降低了eDNA的合成、自聚集体、葡萄黄质的生物合成和环状生物膜的形成。DD处理可以诱导agrA和agrC的表达，调节参与生物膜形成的相关基因，有学者利用感染MRSA的线虫评估了对DD在体内条件下作为一种有效的抗生物膜制剂的潜力，结果表明DD能有效地降低MRSA细胞对线虫肠道的黏附，证明DD在体内的抗生物被膜潜力。Jiang Kai等[82]合成了一系列以QS转录调控蛋白CviR为靶点的恶唑烷酮类化合物ZS-12，对C.violaceumCV026QS具有良好的活性。再以ZS-12为先导化合物，设计合成了18 种3-氨基-2-恶唑烷酮类化合物，初步评价了新型恶唑烷酮化合物对QS的抑制活性。结果表明，其中13 种化合物都对P.aeruginosaPAO1的生物膜形成和毒力因子有抑制作用，其中化合物YXL-13的效果最好。

部分天然QSIs和部分合成QSIs汇总如表1、2所示。

表1 部分天然QSIsTable 1 Some natural QSIs

续表1

表2 部分合成QSIsTable 2 Some synthetic QSIs

4 结 语

在食品加工生产过程中，由于生产周期长、加工设备复杂，一旦形成了生物膜便难以去除，对食品生产造成了巨大损失。目前研究仅局限于部分细菌QS系统调控生物膜形成的分子机制，但对其复杂多层次的调控网络还未能完全了解，不同调控系统间的相互影响还需要进一步探究。另外，虽然目前已将QSIs作为新型的控制生物膜的方法，并在一定程度上避免细菌耐药性的产生，但随着对食品安全的要求越来越高，仍需要对其安全性及作用机制有更深入的研究，阐明常见食源性微生物QSMs参与生物膜形成的调控机制；同时，寻找来源更广泛的天然QSIs，实现对生物膜形成的靶向控制，从而保证食品安全。