解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7对采后脐橙绿霉病的防治作用及机制

阎 然，傅茂润，陈蕾蕾，李有媛，徐敏慧,3，何志平*，周庆新,*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，山东 济南 250353；2.山东省农业科学院农产品研究所，山东 济南 250100；3.诸城一中慈海学校，山东 诸城 262201；4.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

脐橙味甜、清香，经常食用有抗癌、养颜等功效。脐橙果实在世界范围内广泛种植，我国是世界上脐橙种植面积最大的国家[1]。脐橙在采后运输以及贮藏过程中，极易受到病原微生物侵染而腐烂。指状青霉（Penicillium digitatum）是侵染柑橘类果实而使其发生绿霉病的主要真菌[2]。此前，防治脐橙绿霉病的方式主要以化学杀菌剂为主，例如多菌灵、咪鲜胺等[3]。然而，过量使用化学杀菌剂加之其自身固有的缺点，在使用过程中易产生环境污染、人畜中毒、农药残留以及病菌抗药性等一系列问题。因此，利用具有对人畜和环境安全、不受设备条件限制、操作简单、易推广等特点的生物拮抗剂来防治脐橙绿霉病应运而生[4-5]。

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌具有较高亲缘性的革兰氏阳性菌，存在于自土壤、水、空气等环境中[6]。由于其产孢量高、存活能力强、理化性质稳定，被认为是一种有潜力的生防菌[7]。国内外学者广泛地使用解淀粉芽孢杆菌来抑制由采后病原菌所引起的侵染性病害，例如樱桃的褐腐病[8]、苹果的火疫病[9]、猕猴桃的灰霉病[10]。解淀粉芽孢杆菌可分泌较多高活性的抗菌物质，主要为抑菌蛋白、脂肽类、氨基酸类以及聚酮化合物等[11]。解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7是分离自姜田土壤的一株广谱拮抗菌株，对造成采后果蔬品质劣变的多种致病真菌具有良好的抑制作用[12]。本课题组前期研究结果表明解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7对于葡萄灰霉病具有良好的抑制效果[13]。然而，其作为拮抗菌来抑制采后脐橙绿霉病的相关报道较少。本实验主要探讨NCPSJ7对脐橙果实指状青霉的防治效果，分析脐橙体内、外的抗菌作用以及潜在抑菌机制，以期对解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7在果蔬采后病害防治中的应用提供指导意见。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脐橙为市售脐橙，解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7由山东省农业科学院农产品研究所提供；指状青霉由中国科学院植物研究所提供；NCPSJ7的培养和保存使用牛肉膏蛋白胨培养基（nutrient broth，NB）；指状青霉的培养、保存使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）。

愈创木酚 上海源叶生物科技有限公司；乙二胺四乙酸 上海展云化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸、次氯酸钠 上海麦克林生化科技有限公司；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海市申安医疗器械厂；SPX-250生化培养箱 浙江省托普仪器有限公司；YP电子天平 余姚市金诺天平仪器有限公司；BCD-316WGVP海信冰箱 北京市海信电器有限公司；UB100i生物显微镜 重庆市澳浦光电技术有限公司；HNY-200B生物摇床 天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NCPSJ7发酵原液的制备

将NCPSJ7接种在NB平板上，33.8 ℃培养24 h后，挑取单菌落接种于NB液体培养基中，在33.8 ℃、152 r/min条件下培养18 h，即得NCPSJ7发酵原液。使用血球计数板计数，使用含有0.01%（体积分数，后同）吐温-80的无菌水稀释得到不同菌体浓度的发酵原液。

1.3.2 指状青霉孢子悬浮液的制备

将指状青霉接种于PDA平板，28 ℃下恒温培养5 d。刮取适量产孢菌丝放入装有适量无菌水及玻璃珠的10 mL离心管中，漩涡振荡10 s，经两层无菌纱布过滤掉菌丝体得孢子悬浮液[14]。使用血球计数板计数，用含有0.01%吐温-80的无菌水稀释得到1×104CFU/mL的病原菌孢子悬浮液。

1.3.3 不同浓度NCPSJ7对指状青霉的抑菌效果的分析

取100 µL 1×104CFU/mL孢子悬浮液加到PDA平板（直径为90 mm）上并进行反复涂布。涂布30 min后，每个平板中央放入1 个牛津杯，分别添加200 µL呈梯度稀释的NCPSJ7发酵原液（0、1×105、1×106、1×107、5×107、1×108CFU/mL），28 ℃下培养4 d，观察抑菌情况并测量抑菌圈直径。每个处理重复3 次。

1.3.4 指状青霉孢子萌发和芽管长度的测定

将100 µL不同浓度的NCPSJ7培养液（0、1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108CFU/mL）加入到装含有5 mL液体马铃薯葡萄糖肉汤培养基（potato dextrose broth，PDB）的试管中，同时向试管中加入100 µL 1×104CFU/mL的指状青霉孢子悬浮液，在25 ℃的条件下，摇床（50 r/min）培养15 h，进行显微镜观察，在400 倍下用显微测微尺测量指状青霉孢子的芽管长度，按式（1）计算指状青霉孢子的萌发率，每组至少观察200 个孢子。实验共重复3 次。

1.3.5 指状青霉菌丝形态的观察

参照产祝龙[15]的方法并加以改进，对指状青霉菌丝形态进行观察。取培养2 d的指状青霉菌饼倒置放于PDA平板中央，继续培养2 d后，在新长出的菌丝边缘滴加20 µL 1.0×107CFU/mL NCPSJ7培养液，于28 ℃下培养2 d，用锋利的薄片刀片将带有两种微生物的培养基切成小块，用质量分数2.5%戊二醛溶液固定24 h后，转移到体积分数95%的乙醇溶液中静置12 h。然后依次在体积分数95%乙醇、乙酸异戊酯、乙醇-乙酸异戊酯（体积比为3∶1）、乙醇-乙酸异戊酯（体积比为1∶1）、乙醇-乙酸异戊酯（体积比为1∶3）和乙酸异戊酯中进行的脱水处理（每级脱水时间为15 min）。脱水完毕后，常温下干燥5 d。将处理好的样品块用双面交粘到金属台上，用离子溅射仪镀金并在扫描电子显微镜下进行观察拍照。

1.3.6 脐橙果实的发病率和腐烂指数测定

将96 个脐橙分为0、1×108、2×108、3×108CFU/mL组，每组4 筐，每筐6 个脐橙。用灭菌后的钢钉在脐橙赤道位置对称刺2 个直径3 mm、深度3 mm的孔，室温下放置20 min，各组分别加入20 μL无菌水和不同浓度的NCPSJ7发酵原液，室温放置20 h后注入10 μL 104CFU/mL指状青霉孢子悬浮液。放入用次氯酸钠溶液处理食用筐中，聚乙烯保鲜袋密封，在25 ℃条件下贮藏6 d，按式（2）计算贮藏第4、5、6天时果实发病率，在贮藏第6天拍照观察果实表面发病情况，采用十字交叉法测量病斑直径并按式（3）计算果实腐烂指数。

按照果实腐烂部分占总果实的面积将果实分为0～4级，其中，0级果实未腐烂、1级果实腐烂面积比例为1%～25%、2级果实腐烂面积比例为26%～50%、3级果实腐烂面积比例为51%～75%、4级果实腐烂面积比例为76%～100%。

1.3.7 NCPSJ7在脐橙果实伤口处的生长动态

参照朱瑞瑜[16]的方法并稍作改动。用灭菌钢钉在脐橙赤道位置对称刺2 个直径3 mm、深度3 mm的孔，注入20 µL 3×108CFU/mL的NCPSJ7发酵原液，室温干燥后，放入用次氯酸钠溶液处理的食用筐中，聚乙烯保鲜袋密封，25 ℃下持续观察。利用血球计数板统计孔内NCPSJ7数（实验中NCPSJ7完全渗入橙皮组织时作为0 h），连续观察3 d。伤口内NCPSJ7的获取方法：将1 mL无菌水分多次注入伤口内，用移液枪不断吸打，最终获得NCPSJ7悬浮液。每个处理由两个脐橙组成，共3 个平行。实验重复两次。

1.3.8 脐橙果实相关代谢酶活力的测定

用灭菌钢钉在脐橙赤道位置对称刺2 个直径3 mm、深度3 mm的孔，根据不同处理注入浓度为3×108CFU mL的NCPSJ7菌悬液和104CFU/mL指状青霉孢子悬浮液。CK组：20 µL无菌水；指状青霉处理组：10 µL指状青霉孢子悬浮液；NCPSJ7和指状青霉复合处理组：先接种20 µL NCPSJ7培养液，20 h后再注入10 µL指状青霉孢子悬浮液。室温干燥后，放入用次氯酸钠溶液处理的食用筐中，在果盘中放入适量无菌水保持湿度，聚乙烯保鲜袋密封，每隔1 d取样。CK组和复合处理组取打孔处周围1 cm的果皮组织，而指状青霉处理组取病斑周围1 cm的果皮组织。不同处理取下的组织剪碎，用于脐橙酶活性、抗氧化物质含量和能力的测定。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、几丁质酶（chitinase，CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力测定均参照文献[17]。

1.3.9 脐橙果实抗氧化物质含量和抗氧化能力的测定

1.3.9.1 总酚和总黄酮

总酚的测定采用福林-酚比色法[18]，总黄酮采用分光光度法[19]。总酚含量以没食子酸的标准曲线（y＝0.227 7x-0.248 9，R2＝0.992 7）来计算，总黄酮以芦丁的标准曲线（y＝0.489 2x-0.462，R2＝0.993 5）来计算，单位均为mg/g。

1.3.9.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力和还原力1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力以及还原力的测定均参照Qu Qingli等[20]的方法，脐橙果实的DPPH自由基清除能力用DPPH自由基清除率表示，还原力用OD700nm表示。

1.4 数据处理与分析

所有数据均采用SPSS 15.0软件和Excel 2003软件进行分析。实验设置3 个平行，数据用平均值±标准差表示。采用单因素方差分析中的邓肯检验进行显著性差异分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的NCPSJ7对指状青霉的抑菌效果

在离体实验中，不同浓度的NCPSJ7均对指状青霉有较为明显的抑制效果（图1A），并且抑菌圈的直径随着NCPSJ7浓度的升高而显著增加（P＜0.05）（图1B），当NCPSJ7浓度为1×108CFU/mL时，抑菌圈直径为3.50 cm，是1×105CFU/mL NCPSJ7处理组抑菌圈直径（1.75 cm）的2 倍。由此可知，在一定范围内NCPSJ7浓度越高，抑菌效果越明显。

图1 不同浓度的NCPSJ7对指状青霉的抑菌活性（A）和抑菌圈直径（B）的影响Fig.1 Effects of different concentrations of NCPSJ7 against P.digitatum: antifungal activity (A) and diameter of inhibition zones (B)

2.2 不同浓度NCPSJ7对指状青霉孢子萌发率和芽管长度的影响

不同浓度NCPSJ7对指状青霉孢子萌发率和芽管长度的影响如图2所示，随着NCPSJ7浓度的升高，指状青霉孢子萌发率和芽管长度均明显下降。当NCPSJ7的浓度从2.5×107CFU/mL增加至5×107CFU/mL时，指状青霉的孢子萌发率由70%下降至24%。当NCPSJ7浓度提高至1×108CFU/mL时，指状青霉的孢子萌发率仅为5%（图2A）。这表明NCPSJ7能明显抑制指状青霉孢子的萌发率，相似地，当NCPSJ7菌液浓度为7.5×107CFU/mL时，指状青霉的芽管长度为2.01 μm，而NCPSJ7浓度提高至1×108CFU/mL时，指状青霉的芽管长度仅为0.6 μm，较NCPSJ7菌液浓度为7.5×107CFU/mL时减小了约70%（图2B）。由此可见，NCPSJ7也能明显抑制指状青霉芽管长度的增加。

图2 不同浓度NCPSJ7对指状青霉孢子萌发率（A）和芽管长度（B）的影响Fig.2 Effects of different concentrations of NCPSJ7 on spore germination (A) and germ tube length (B) in P.digitatum

2.3 NCPSJ7对指状青霉菌丝形态的影响

由图3A可知，指状青霉菌丝表面光滑，菌丝数量多。而加入NCPSJ7后，大量的拮抗菌附着于指状青霉菌丝的表面，使菌丝无法正常生长，出现表面粗糙、菌丝稀疏的现象（图3B）。

图3 扫描电子显微镜下观察NCPSJ7对指状青霉菌丝的影响Fig.3 Effects of NCPSJ7 on the mycelium of P.digitatum under scanning electron microscope

2.4 NCPSJ7在脐橙伤口处的生长动态

如图4所示，NCPSJ7可在24 h时快速定植在脐橙表面的伤口处，且在48 h达到峰值，之后趋于平稳。这表明NCPSJ7能较长时间存在于植物体内，对植物产生持续性保护，可更好地延长果实的货架期。同时这也证明NCPSJ7能够抢占指状青霉生长所需的营养和空间。

图4 NCPSJ7在脐橙伤口处的生长动态Fig.4 Growth curve of NCPSJ7 in wounds in oranges

2.5 不同浓度NCPSJ7和指状青霉在脐橙上的互作效果

不同浓度NCPSJ7和指状青霉在脐橙上的互作效果如图5所示。与0 CFU/mL NCPSJ7组相比，不同浓度的NCPSJ7均使脐橙的发病数量和发病的严重程度明显降低。并且随着NCPSJ7浓度的不断增加，效果更为明显。

图5 不同浓度NCPSJ7和指状青霉在脐橙上的互作效果Fig.5 Inhibitory effect of different concentrations of NCPSJ7 on navel oranges inoculated with P.digitatum

2.6 不同浓度NCPSJ7对脐橙果实发病率、病斑直径和腐烂率的影响

如图6所示，随着NCPSJ7浓度的增加，脐橙果实的发病率、腐烂指数以及病斑直径均呈下降趋势。其中当贮藏时间相同时，3×108CFU/mL NCPSJ7处理组果实发病率显著低于其他处理组（P＜0.05）（图6A）。这表明NCPSJ7能明显抑制果实的发病率，且高浓度NCPSJ7效果更好。相似地，脐橙经过3×108CFU/mL NCPSJ7处理后，果实的腐烂指数和病斑直径均显著低于其他处理组（P＜0.05）（图6B、C）。

图6 不同浓度NCPSJ7对脐橙发病率（A）、腐烂指数（B）和病斑直径（C）的影响Fig.6 Effects of different concentrations of NCPSJ7 on decay incidence (A), decay index (B) and lesion diameter (C) in orange fruit inoculated with P.digitatum

2.7 NCPSJ7对脐橙果实抗病相关酶活力的影响

如图7A所示，脐橙在贮藏0～4 d时，复合处理处理组果实内PPO活力高于指状青霉组和CK组，说明NCPSJ7主要在果实贮藏的前期对PPO的活性产生积极影响。如图7B所示，脐橙果实在贮藏第1天时，复合处理处理组的POD活力为201.67 U/gmf，显著高于CK组和指状青霉处理组（P＜0.05）。如图7C、D所示，复合处理组果实的CHI和GLU活性在贮藏第4天显著高于CK组和指状青霉处理组（P＜0.05）。

图7 3×108 CFU/mL NCPSJ7对脐橙果实抗病相关酶活性的影响Fig.7 Effect of 3 × 108 CFU/mL NCPSJ7 on defense-related enzyme activities in inoculated navel oranges

2.8 NCPSJ7对脐橙果实抗氧化物质含量和抗氧化能力的影响

如图8所示，随着贮藏时间的延长，脐橙果实的抗氧化物质（总酚和总黄酮）含量和抗氧化能力（DPPH自由基清除能力和还原力）均不断升高。从图8A可以看出，指状青霉单一处理组和CK组的总酚含量分别在贮藏第3天和第4天均呈现不同程度的下降，而复合处理处理组在果实贮藏至第5天时仍处于上升的状态。在贮藏至第5天时，复合处理果实中总酚含量为1.57 mg/g，分别是对照处理（1.08 mg/g）和单一处理（1.30 mg/g）的1.45 倍和1.21 倍。果实中的总黄酮含量在不同的处理组中出现峰值的时间有所差异。指状青霉单一处理在贮藏第3天出现峰值，而对照组和复合处理组出现峰值的时间分别为第4天和第5天（图8B）。从图8C、D中可以看出，在贮藏中后期（第4～6天），复合处理处理组果实中DPPH由基清除能力和还原力均显著高于指状青霉处理组和CK组（P＜0.05）。

图8 3×108 CFU/mL NCPSJ7对脐橙果实抗氧化物质含量和能力的影响Fig.8 Effect of 3 × 108 CFU/mL NCPSJ7 on bioactive substance contents and antioxidant capacity in inoculated navel oranges

3 讨 论

真菌病原体一旦附着于果实表皮，可通过果实自身的伤口和气孔获取营养，这可能刺激其孢子萌发和芽管伸长，从而造成严重的采后病害[21]。体外研究发现，NCPSJ7可以显著抑制指状青霉的孢子萌发率和芽管长度，并且对于NCPSJ7的浓度具有一定的依赖性，即抑菌效果随NCPSJ7的浓度增大而增强，且体内外实验结果相一致。这在Zhu Huimin等[22]的研究中得到证实，其认为高浓度的拮抗酵母Yarrowia lipolytica可以显著抑制指状青霉和意大利青霉孢子萌发和芽管伸长，且体内外抑制效果均直接取决于NCPSJ7的浓度。

生物拮抗过程中一种重要机制为拮抗菌通过竞争空间和营养来抑制致病菌的生长繁殖。Zhang Xuehua等[23]将Bacillus amyloliquefaciensCMN1308应用于防治板栗采后病害中，发现其对根霉、腐皮镰刀菌、葡萄穗霉属、青霉菌和黑曲霉等致病菌表现出了极强的空间和营养竞争现象。本实验研究了NCPSJ7在脐橙伤口处的生长动态变化，发现NCPSJ7可在24 h快速定植在果实伤口处，48 h到达顶峰，随后保持稳定状态。电子显微镜观察的结果表明，NCPSJ7生长较为密集的区域，指状青霉的菌丝表面粗糙且数量较少，推测原因为NCPSJ7通过抢夺空间和营养来抑制指状青霉的生长。

当植物受到病原菌侵染时，在启动自我防御的早期阶段会出现活性氧的爆发，导致大量过氧化氢、超氧阴离子等中间体在植物细胞积累并造成伤害。因此，植物中存在着大量的抗氧化酶以防御氧化胁迫[24]。POD、PPO可参与调节植物细胞活性氧代谢过程并使其处于动态平衡之中。此外，二者均参与宿主植物细胞的木质化过程，是引起病原菌侵染防御反应的关键酶。郑香香等[25]研究发现芽孢杆菌通过在杏果实贮藏的前中期诱导PPO的POD活性增加来提高果实的抗病性，起到保鲜效果。Zhu Huimin等[22]的研究表明拮抗酵母可在柑橘果实贮藏前期和中期诱导PPO和POD活性到达峰值，其活性的升高与果实病害的下降呈正相关关系。本实验研究也发现NCPSJ7在果实贮藏前中期可以诱导PPO活性的增加并且显著而快速的诱导POD活性高峰的出现。CHI和GLU是植物系统获得抗病性的标志，可水解致病菌细胞膜中几丁质和葡聚糖，通过破坏原生质膜将其杀死[26]。且GLU和CHI会协同作用于病原微生物细胞膜的降解[27]。拮抗菌B.amyloliquefaciensMG-3接种于枇杷后可诱导产生GLU和CHI，从而提高对炭疽病菌的抗性和降低果实的发病率和褐变度[28]。与之类似的作用结果在荔枝[29]、樱桃番茄[24]、柑橘[22]、葡萄柚[30]等果实均有报道。本实验也发现NCPSJ7可在脐橙果实贮藏后期可协同诱导GLU和CHI的活性提高。以上结果表明果实的抗病性可通过拮抗菌诱导防御酶活性的升高来获得。

酚类物质氧化形成的醌类物质是潜在的抗病因子，因此酚类物质具有直接抗病性[31]，同时也具有一定的抗氧化性。本研究结果表明，总酚、总黄酮的含量在果实贮藏前中期呈不断上升的变化趋势并且指状青霉处理组显著高于对照组和复合处理处理组，推测原因为指状青霉处理组的脐橙病变程度更高，果实在高病害侵染条件下所产生的应激反应。该现象与酚类物质在病原菌入侵后含量升高并参与抵抗龙眼的拟茎点霉菌[32]、草莓的灰霉菌[33]相一致。另外，总酚、总黄酮在复合处理处理组中随着果实贮藏时间的延长而不断积累，从而在果实贮藏后期表现出更强大地防御病害侵染的能力。当果实遭到病原菌入侵或自身细胞衰老等因素出现时，自由基生成过多或清除能力减弱会导致细胞结构和功能遭到破坏，进而使细胞失去防御能力[34]。相比于指状青霉单一处理和CK组，复合处理处理组的脐橙果实在贮藏中期显著提高DPPH自由基清除能力和还原力，并且能不断提高直至贮藏结束。这可能是由于NCPSJ7的存在能减轻指状青霉对果实的损害，保护果实中总酚、黄酮等有机自由基清除剂，促进POD和PPO活性增强，进而使果实总体抗氧化能力得到提升。这或许也是解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抑制绿霉病发生的机理之一。

解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7能显著降低指状青霉的发病率、病斑直径和腐烂指数。NCPSJ7对指状青霉的作用机制主要包括以下3 个方面：1）NCPSJ7可以迅速定植在脐橙伤口内部，通过竞争空间和营养来抑制指状青霉菌丝的生长；2）NCPSJ7诱导抗性相关酶PPO、POD、CHI和GLU活性增加，从而增强果实对指状青霉的抵抗能力；3）NCPSJ7提高了脐橙总酚、总黄酮含量以及DPPH自由基的清除能力和还原力，增加了果实的抗氧化能力以抑制脐橙绿霉病的发生。综上，解淀粉菌NCPSJ7可作为一种有效抑制脐橙果实绿霉病的生物拮抗剂。