4-氨基喹唑啉类衍生物的合成及体外抗肿瘤活性

刘海彬, 李增强

(1.辽宁科技学院 生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪 117004；2.沈阳药科大学 制药工程学院，辽宁 沈阳 110016)

喹唑啉类化合物是一类具有较高生物活性的含氮杂环化合物，在医药和农药领域有着广泛的应用，其生物活性主要表现抗菌[1-2]、抗肿瘤[3-4]、抗真菌[5-6]、抗炎[7-8]、抗病毒[9]、抗惊厥[10]、抗HIV活性[11]等。研究发现，N-取代的4-氨基喹唑啉化合物通过与ATP的结合位点结合，能够抑制表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化，从而表现出抑制肿瘤生长的作用[12-14]。为了寻找高活性的先导化合物，设计合成了4-氨基喹唑林衍生物3(Scheme 1)。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WRS-1B型数字熔点仪(温度计未经校正)；Bruker avance 600 MHz型核磁共振仪(TMS 为内标)；Thermo LCQ Fleet HPLC-MS型质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮(1)的合成

称取4,5-二甲氧基-2-氨基苯甲酸8.0 g(0.04 mol)溶解于100 mL无水乙醇中，在搅拌下加入醋酸甲脒8.4 g(0.08 mol)，加热回流10 h，然后冷却至室温，用旋转蒸发器旋去溶剂，加入50 mL饱和碳酸氢钠溶液调节pH=7～8，过滤，滤饼用少量水淋洗，得灰色粉末状固体(1)7.89 g，产率94.3%。

(2)4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉(2)的合成

称取6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮(1)6.44 g(0.0311 mol)溶解于155 mL二氯亚砜中，滴加3滴DMF，待完全溶后加热回流1 h，冷却至室温，减压蒸除二氯亚砜，得黄色固体。将黄色固体慢慢加入冰水中，用氨水调节其pH=7～8，过滤，干燥，得淡黄色固体(2)6.48 g，产率92.3 %。

(3)化合物3的合成(以3a的合成为例)

称取20.50 g(2.2 mmol)溶解于22 mL异丙醇中，完全溶解后加入乙醇胺0.15 g(2.4 mmol)，于90 ℃回流5 h，冷却至室温，减压抽滤，干燥，用异丙醇重结晶得3a。

3a: 白色固体，产率63.5%，m.p.236.4～237.2 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 8.33(s, 1H), 7.96(s,J=4.8 Hz, 1H), 7.62(s, 1H), 7.09(s, 1H), 4.84(t,J=5.4 Hz, 1H), 3.90(s, 3H), 3.89(s, 3H), 3.63(t,J=5.4 Hz, 2H), 3.61(t,J=5.4 Hz, 2H); MS(ESI)m/z: 250.27{[M+H]+}。

3b: 黄色固体，产率52.4%，252.7～253.6 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 11.32(s, 1H), 8.87(s, 1H), 8.32(s, 1H), 8.05(t,J=1.8 Hz, 1 H), 7.79(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.49(d,J=8.4 Hz, 1 H), 7.46(t,J=7.8 Hz, 1 H), 7.35(s, 1H), 4.03(s, 3H), 4.01(s, 3H); MS(ESI)m/z: 360.35{[M+H]+}。

3c: 浅黄色固体，产率58.9%，247.3～248.7 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 12.92(s, 1H), 11.77(s, 1H), 8.89(s, 1H), 8.28(s, 1H), 7.83(d,J=1.8 Hz, 1H), 7.35(s, 1H), 6.85(d,J=1.8 Hz, 1H), 4.00(s, 3H), 3.99(s, 3H); MS(ESI)m/z: 272.28{([M+H]+}。

3d: 白色固体，产率95.3%，187.1～187.4 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 11.84(s, 1H), 8.82(s,1H), 8.42(s,1H), 7.78(d,J=9.6 Hz, 1 H), 7.56(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.54(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.43(s, 1H), 4.02(s, 3H), 4.01(s, 3H); MS(ESI)m/z: 378.36{[M+H]+}。

3e: 白色固体，产率89.75%，230.0～231.2 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 600 MHz)δ: 11.54(s, 1H), 8.62(s, 1H), 8.04(s, 1H), 7.46,(s, 1H), 7.19(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.12～7.09(m, 2H), 7.04(t,J=6.6 Hz, 1H), 4.09(s, 3H), 3.97(s, 3H), 2.22(s, 3H); MS(ESI)m/z: 296.32{[M+H]+}。

1.3 体外抗肿瘤活性测试

用MTT(四氮唑蓝)比色法测试了化合物的体外培养肿瘤细胞的抑制活性。实验所用肿瘤细胞株分别为人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞(A549)和人前列腺癌细胞(PC-3)。样品用DMSO溶解后，用培养基溶剂配成0.1、1.0、10和100 μmol/L不同浓度的溶液。将对数生长期的细胞制成细胞悬液，以180 μL/孔接种到96孔板中，置于37 ℃、含5%的CO2、饱和湿度的培养箱中孵育24 h。各个剂量的药液加入96孔板中，每剂量3个复孔，放入培养箱中孵育72 h。然后加入配置好的MTT溶液，放入培养箱中继续孵育4 h，每孔加100 μL的DMSO，使用酶标仪在492 nm处测光密度(OD)值。

1.4 分子对接实验

利用AutoDockTools软件，选取PDB数据库中的DNA序列 d(CGATCG)(PDB: 1D12)[15]为模型，进行分子对接研究。去除PDB:1D12中的水分子、清洁蛋白等操作，3b及ADM(阿霉素)的三维结构均由Marvin Sketch构建，再将准备好的DNA序列与小分子化合物进行对接研究。

2 结果与讨论

2.1 体外抗肿瘤活性

采用常规的MTT比色法，测试了3对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞(A549)和人前列腺癌细胞(PC-3)的体外抗肿瘤活性，并与ADM(阿霉素)进行了对照，结果见表1。从中可见，所合成的化合物对3种人肿瘤细胞的体外生长显示不同的抑制作用，但远远低于对照药ADM的抑制活性。3b对人肺癌细胞(A549)和人前列腺癌细胞(PC-3)显示出弱的抑制活性，IC50值分别为43.686和32.157 μmol/L；3e对人肺癌细胞(A549)显示出弱的抑制活性，IC50值为57.595 μmol/L。但5种化合物在最大浓度(10-4mol/L)时对于人口腔表皮样癌细胞(KB)的抑制率均未达到50%，化合物3c和3d对3种癌细胞均无明显的抑制活性。

表1 化合物3a～3e对MCF-7、A549和PC-3细胞的IC50值

2.2 分子对接

利用AutoDockTools软件，对ADM和3b与DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)进行了分子对接。化合物3b与PDB: 1D12对接后的能量值为-5.69，ADM(阿霉素)的能量值为-6.35，对接结果显示：本文设计并合成的化合物应具有一定的活性。同时，研究结果也获得了3b与DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式图，3b插入到了DNA序列的活性口袋中，这种作用方式与ADM和DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式较接近。而从对接方式显示，进一步引入取代基，可能会获得更加理想的化合物。

图1 (a)ADM与DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式图;(b)3b与DNA序列d(CGATCG)(PDB: 1D12)的作用方式图。

合成了5个4-氨基喹唑啉的化合物，经1H NMR和MS对其结构进行了表征。通过体外抗肿瘤活性实验，发现目标化合物3b、3d和3e对人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人前列腺癌细胞PC-3表现出一定的抑制活性。分子对接结果显示：3b和ADM 与DNA序列(PDB: 1D12)具有相近的能量值和类似的作用方式，也进一步证明了此类化合物具有一定的活性。