新工艺制备的咳喘六味合剂治疗哮喘小鼠的作用机制研究

杨帆平 奚 燕

1.上海中医药大学附属普陀医院临床试验机构办公室，上海 200062；2.上海中医药大学附属龙华医院药学部，上海 200032

哮喘是一种常见的呼吸道疾病，主要由免疫介导引起气道反应性增高，形成慢性气道炎症，在不同的国家有1%～18%的人群受到侵袭[1]。据研究统计中国大陆成年人哮喘患病率为1.81%[2]，患病率有逐年升高的趋势[3]。

吸入糖皮质激素是治疗轻度和中度哮喘的主要手段之一[4]。咳喘六味合剂是上海中医药大学附属龙华医院的院内制剂，由麻黄、附子、细辛、桃仁、黄芩及虎耳草组成，具有温阳抗寒、化痰平喘之功[5-6]。课题组前期已对咳喘六味合剂原有制备工艺中加水量、提取次数、提取时间、乙醇用量及其浓度等工艺条件进行了优化，提高了麻黄中麻黄碱和伪麻黄碱以及黄芩中黄芩苷的转移率并制订了质量标准[7]。本研究通过观察新工艺制备的咳喘六味合剂对哮喘小鼠的气道反应性、肺组织病理变化以及炎症反应的作用，验证其对哮喘病症的有效性并探讨其作用机制[8-10]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性BALB/c 小鼠，6～8 周龄，体重18～26 g，清洁级，由上海斯莱克公司提供，动物合格证号：SCXK（沪）2017-0003。动物实验中心饲养，环境温度18～22℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h 光暗循环。本研究设计和操作均严格按照上海中医药大学动物实验伦理原则进行。小鼠自购入起，适应性饲养1 周后实验。

1.2 试药和仪器

咳喘六味合剂（新工艺）（上海中医药大学附属龙华医院，批号：1706001）；地塞米松（上海上药信谊制药有限公司，批号：015161004）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美国Sigma 公司，货号：A5503）；氢氧化铝凝胶（美国Sigma 公司，货号：V900163）；白细胞介素（in terleukin，IL）-13 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海西唐生物，货号：F10890）；IL-17 ELISA 试剂盒（上海西唐生物，货号：F10910）；γ 干扰素（IFN-γ）ELISA 试剂盒（上海西唐生物，货号：F10660）；无创式动物肺功能检测仪（美国Buxco 公司，型号：FinePointeTMNAM）；正置显微镜（日本OLYMPUS 公司，型号：CX41）；恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司，型号：DHG-9023A）；石蜡切片机（湖北徕克医疗仪器有限公司，型号：SQ2125）；多功能酶标仪（芬兰Thermo 公司，型号：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）；离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-168），旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂，型号：XW-80A）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与哮喘模型制备 将小鼠按随机数字表法分为对照组、哮喘模型组、咳喘六味合剂（新工艺）低剂量组、咳喘六味合剂（新工艺）高剂量组和地塞米松组，每组6 只。除对照组外，其他各组小鼠分别于第0、7、14 天进行腹腔注射致敏液（0.08% OVA 0.1 ml＋氢氧化铝凝胶0.1 ml）致敏，对照组小鼠给予等剂量生理盐水。第21 天起将小鼠置于密闭雾化吸入箱中，予1% OVA 30 ml 雾化激发，对照组小鼠给予等剂量生理盐水雾化激发，各组小鼠激发30 min，1 次/d，连续10 d。当小鼠出现躁动、呼吸急促、擦鼻、打喷嚏、腹肌收缩等症状，提示造模成功。每次雾化激发前30 min 给药，对照组和哮喘模型组给予生理盐水灌胃，咳喘六味合剂（新工艺）低剂量组给予咳喘六味合剂（新工艺）15.5 g/kg 灌胃；咳喘六味合剂（新工艺）高剂量组给予咳喘六味合剂（新工艺）31 g/kg 灌胃；地塞米松组给予地塞米松3 mg/kg 灌胃[11-13]。

1.3.2 小鼠气道反应性测定 采用无创的整体体积描记法测量各组小鼠的气道反应性，以呼气间歇（enhanced pause，Penh）值来表示气道受限程度。使用无创式动物肺功能检测仪，将小鼠密封放置于特定的描记器内，按照仪器使用说明操作，待小鼠适应5 min稳定后，依次用浓度梯度为0.000、3.125、6.250、12.500和50.000 mg/ml 的乙酰甲胆碱（Methacholine，Mch）激发小鼠，每次激发时间不超过1.5 min，间隔3 min，记录各浓度激发后的Penh 值。

1.3.3 小鼠肺组织HE 染色观察 取小鼠左肺组织，厚度0.2～0.3 cm，大小为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 为宜，置10%福尔马林中固定48 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE 染色后，显微镜（200×）下观察肺组织和炎症细胞浸润情况[14]。

1.3.4 小鼠血清IL-13、IL-17、IFN-γ 的含量测定离心（4℃，离心速率2500 r/min，时间10 min）后收集各组小鼠血清，严格按照ELISA 试剂盒说明书进行实验操作和检测[15-16]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，方差齐则多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐多组间的比较用Welch Brown 检验，组间两两比较则用Games-Howell test 检验。以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠雾化激发后的行为表现

对照组小鼠行为表现一切如常。哮喘模型组、咳喘六味合剂（新工艺）低剂量组、咳喘六味合剂（新工艺）高剂量组、地塞米松组小鼠均雾化激发哮喘成功。其中哮喘模型组小鼠表现出不喜活动、眼神呆滞、精神状态逐渐变差，呼吸频率较为急促，腹部伴随呼吸抽动，两前爪频繁挠动、擦拭鼻子；各给药组小鼠也观察到以上表现，但程度较哮喘模型组轻。

2.2 各组小鼠受到不同浓度Mch 激发后的Penh 值比较

当Mch 浓度为6.250、12.500、50.000 mg/ml，哮喘模型组Penh 值高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；咳喘六味合剂（新工艺）低剂量组、咳喘六味合剂（新工艺）高剂量组、地塞米松组Penh 值低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠受到不同浓度Mch 激发后的Penh 值比较（）

表1 各组小鼠受到不同浓度Mch 激发后的Penh 值比较（）

注：与对照组同浓度比较，aP <0.05；与哮喘模型组同浓度比较，bP<0.05

2.3 各组小鼠肺组织病理变化

对照组小鼠肺组织结构清晰、完整，支气管、肺泡等正常，未见明显的炎症细胞。哮喘模型组小鼠肺组织结构紊乱，支气管变窄、壁变厚，周围有炎症细胞。咳喘六味合剂（新工艺）低剂量组、咳喘六味合剂（新工艺）高剂量组、地塞米松组小鼠肺组织稍显改变，结构尚好；支气管均有不同程度的变形，但变窄变厚程度轻于哮喘模型组，有少量炎症细胞。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化（HE 染色，200×）

2.4 各组小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比较

哮喘模型组血清IL-13、IL-17、IFN-γ 水平与对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；咳喘六味合剂（新工艺）低剂量组、咳喘六味合剂（新工艺）高剂量组、地塞米松组血清IL-13、IL-17、IFN-γ 水平与哮喘模型组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比较（mg/ml，）

表2 各组小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比较（mg/ml，）

注：IL：白细胞介素；IFN-γ：γ 干扰素

3 讨论

炎症被认为是哮喘发病的核心，临床表现为气道高反应性与可逆性气流受限[17-18]，而Th1/Th2 亚群比例失衡和功能失调被认为是哮喘发病的关键环节[19-20]。IL-13 是执行Th2 细胞分化的主要细胞因子[21]，当哮喘形成时IFN-γ 明显下降，Th2 细胞分化占据优势，导致IL-13 等细胞因子大量产生[22-23]。IL-17 对于哮喘炎症起着关键作用，哮喘形成时，IL-17 呈高表达状态[24-25]。

咳喘六味合剂全方配伍，可振奋肾阳。相关研究证实[26]，温阳补肾可以调节Th1/Th2 的比例和功能失衡，从而改善气道炎症。麻黄中的总生物碱可调节哮喘模型大鼠IL-4、IL-13、IFN-γ 等炎症因子的表达[27]；黄芩苷能作用于HMGB1-TLR4 信号通路，影响其信号传导，抑制下游炎症反应递质的释放，阻断炎症反应的级联效应，减轻气道炎症反应[28]；细辛中所含挥发油可松弛支气管平滑肌，抑制气道炎症反应，降低哮喘发病率[29]。

本研究结果显示，新工艺制备的咳喘六味合剂对哮喘小鼠有一定的治疗作用，可以缓解气道高反应，减轻呼吸气流受限程度，改善肺组织病理状态；而对于相关炎症因子的调节作用将做进一步研究。