MIF依赖性巨噬细胞在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用

徐文倩 李金红 郑智华

【关键词】巨噬细胞迁移抑制因子;巨噬细胞;急性肾损伤;肾脏炎症

急性肾损伤（AKI）在临床中较为常见。在AKI早期阶段的肾小管损伤中，炎症起关键作用，肾脏中可观察到大量炎性细胞因子释放和炎性细胞浸润。注射脂质体氯膦酸盐系统性耗竭单核细胞和巨噬细胞可缓解AKI，体现了巨噬细胞在AKI中的重要性[1]。其中，M1型巨噬细胞参与促炎反应导致肾脏损伤，而M2型巨噬细胞参与抗炎反应抑制肾脏损伤[2-3]。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是免疫和炎症反应的上游细胞因子，参与AKI的损伤和修复[4-7]。近年研究结果阐明了MIF在肾小球肾炎中的致病作用[8-10]。阻断MIF可以部分逆转快速进展新月体肾小球肾炎的肾损伤;MIF基因敲除或药理学阻断对AKI有保护作用[11-12]。然而，MIF是否通过巨噬细胞促进AKI尚无定论。本研究旨在阐明MIF依赖性巨噬细胞在AKI中的具体作用和机制。

材料与方法

一、主要试剂

顺铂（美国SigmaAldrich）;肌酐检测试剂盒（南京建成）;胎牛血清（美国ThermoFisherScientific）;大鼠抗小鼠Mincle抗体（美国MBL），兔抗小鼠iNOS抗体（美国Abcam）;山羊抗小鼠MCP-1抗体（美国SantaCruz），山羊抗小鼠TNF-α抗体（美国SantaCruz）;LiberaseTM（美国Roche）;流式固定液，流式染色液（美国eBioscience）;APC标记的抗小鼠NOS2抗体（美国eBioscience），AlexaFluor?488标记的抗小鼠Mincle抗体（美国SantaCruz），PECy5标记的抗小鼠F4/80抗体（美国eBioscience）;苏木素-雪夫试剂（美国SigmaAldrich）。

二、造模方法和分组

3只6～8周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠、27只6～8周龄MIF基因敲除（MIF-/-）雄性小鼠（C57BL/6J背景）由香港中文大学惠赠。其中，3只野生型雄性小鼠和3只MIF-/-雄性小鼠用于培养骨髓来源的巨噬细胞。24只MIF-/-雄性被随机分为正常对照组（n=6）和实验组（n=18）。小鼠飼养于标准环境，自由进食、饮水，而且保持12h（光照）∶12h（黑暗）的昼夜循环，小鼠培养完全符合相关管理要求，所有动物操作均按照中山大学有关动物保护和管理办法执行，研究过程符合动物伦理要求。

正常对照组小鼠尾静脉注射生理盐水。实验组小鼠腹腔注射顺铂，剂量为20mg/kg，建立顺铂诱导的AKI模型（Cis-AKI）。建模6h后将18只实验组小鼠随机分为AKI模型组、巨噬细胞对照组和MIF-/-巨噬细胞组（每组n=6）。AKI模型组的小鼠通过尾静脉注射生理盐水，巨噬细胞对照组的小鼠通过尾静脉注射2×106个提取自野生型小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDM），MIF-/-巨噬细胞组的小鼠通过尾静脉注射2×106个提取自MIF-/-小鼠的BMDM。3d后处死小鼠，留取血清和肾脏组织标本。

三、BMDM培养和转移

物理分离野生型C57BL/6J和MIF-/-小鼠的骨髓细胞。将骨髓细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS）和50ng/ml巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的DMEM/F12培养基中，培养7d后得到成熟的巨噬细胞，期间每3d更换培养基。收取成熟的BMDM，用F4/80抗体鉴定BMDM纯度>98%，并用预冷的盐水以每毫升5×106个细胞的密度重悬。顺铂注射6h后将2×106个BMDM细胞通过尾静脉注射到各组小鼠体内。

四、血清肌酐检测

离心管中的血样在室温下静置1h，待血液凝固、血清析出后，4000转/分离心10min取上层血清。采用南京建成肌酐定量分析试剂盒，按照说明书中的方法步骤进行操作：将肌酐标准品、双蒸水和血清样品分别加入96孔板中，每孔6μl，复孔;每孔加入酶溶液A180μl，轻轻拍板混匀;37℃下孵育5min，酶标仪（546nm）测定吸光度值A1;每孔加入酶溶液B60μl，轻轻拍板混匀;37℃下孵育5min，酶标仪（546nm）测定吸光度值A2;根据计算公式算出待测血清的肌酐水平。每组测量3个样品。

五、过碘酸雪夫（PAS）染色

将石蜡包埋的肾脏组织切成4μm厚的薄片，脱蜡复水后用雪夫试剂孵育30min至组织呈淡粉色，流水冲洗5min后，可见组织变为深粉红色。持续冲洗玻片15min，然后用苏木素复染1min，3%冰醋酸复染15s，流水冲洗至少30min。在室温下风干玻片并封片。

六、免疫组织化学（免疫组化）染色

4μm肾脏组织常规切片后，用3%过氧化氢溶液封闭，一抗湿盒中4℃孵育过夜，一抗分别为：兔抗小鼠F4/80单克隆抗体（1∶200），山羊抗小鼠MCP-1单克隆抗体（1∶200），山羊抗小鼠TNF-α单克隆抗体（1∶200）。辣根过氧化物标记的IgG二抗室温孵育1h，用DAB显色，苏木素染1min，3%冰醋酸复染15s，在室温下风干玻片并封片，在显微镜下观察并计数，每组计数3个样品，每个样品计数5个高倍镜视野并取平均值。

七、流式细胞仪检测

肾脏组织剪碎后用1%LiberaseTM消化成单细胞悬液，然后用流式固定液固定20min。取106个细胞重悬在100μl流式染色液中，抗体4℃孵育过夜，抗体分别为APC标记的抗小鼠NOS2单克隆抗体（1∶100），AlexaFluor?488标记的抗小鼠Mincle单克隆抗体（1∶100），PECy5标记的抗小鼠F4/80单克隆抗体（1∶100），次日加入1ml磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，离心后去除上清，用200～500μl流式染色缓冲液重悬，用BDFACSAriaⅢ流式细胞仪分析荧光信号，用FlowJo软件进行数据处理。每组测量3个样品。

八、统计学处理

采用GraphPadPrism6.0进行数据的统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni法，文中所示P值均为校正后P值。α=0.05。

结果

一、4组小鼠肾脏组织病理和血清肌酐的比较

与AKI模型组相比，巨噬细胞对照组小鼠的血清肌酐水平升高（t=8.318，P<0.001），MIF-/-巨噬细胞组小鼠的血清肌酐水平比较差异无统计学意义（t=1.195，P>0.999），巨噬细胞对照组和MIF-/-巨噬细胞组小鼠的肾小管坏死加重（t=14.770，P<0.001;t=5.427，P=0.004）。与巨噬细胞对照组相比，MIF-/-巨噬细胞组小鼠的血清肌酐水平降低（t=7.122，P<0.001），肾小管损伤程度减轻（t=9.347，P<0.001），见图1。给Cis-AKI小鼠注射巨噬细胞可加重小鼠肾小管结构和肾功能损伤，注射MIF-/-巨噬细胞则小鼠肾小管结构和腎功能损伤明显减轻，说明巨噬细胞加重Cis-AKI小鼠的肾小管结构和肾功能损伤是MIF依赖性的。

二、4组小鼠肾脏炎症因子的比较

免疫组化染色结果显示，与AKI模型组相比，巨噬细胞对照组小鼠肾脏中MCP-1和TNF-α的蛋白表达水平升高（t=5.435，P=0.004;t=10.700，P<0.001），MIF-/-巨噬细胞组小鼠肾脏中TNF-α的蛋白表达水平升高（t=0.708，P>0.999;t=3.562，P=0.044）。与巨噬细胞对照组相比，MIF-/-巨噬细胞组小鼠肾脏中MCP-1和TNF-α的蛋白表达水平降低（t=4.727，P=0.009;t=7.141，P<0.001），见图2。给Cis-AKI小鼠注射巨噬细胞可加重小鼠肾脏炎症损伤，注射MIF-/-巨噬细胞则小鼠肾脏炎症因子表达明显减轻，说明巨噬细胞加重Cis-AKI小鼠的肾脏炎症损伤是MIF依赖性的。

三、4组小鼠巨噬细胞比例的比较

流式分析结果显示，与AKI模型组相比，巨噬细胞对照组和MIF-/-巨噬细胞组小鼠肾脏中M1型巨噬细胞的比例升高（t=28.020，P<0.001;t=8.725，P<0.001）。与巨噬细胞对照组相比，MIF-/-巨噬细胞组小鼠肾脏中M1型巨噬细胞的比例降低（t=19.300，P<0.001），见图3。而且，与AKI模型组相比，巨噬细胞对照组小鼠肾脏中Mincle+M1型巨噬细胞的比例升高（t=23.650，P<0.001;t=3.252，P=0.070）。与巨噬细胞对照组相比，MIF-/-巨噬细胞组小鼠肾脏中Mincle+M1型巨噬细胞的比例降低（t=20.400，P<0.001），见图3。给Cis-AKI小鼠注射巨噬细胞可促进Mincle表达和M1型巨噬细胞激活，注射MIF-/-巨噬细胞则小鼠Mincle表达和M1型巨噬细胞比例明显减少，说明巨噬细胞促进Cis-AKI小鼠的肾脏Mincle表达和M1型巨噬细胞激活是MIF依赖性的。

讨论

AKI是由多种病因导致、涉及多学科的临床常见重症，是慢性肾脏病的主要原因。目前尚无AKI的特效治疗药物。缺血-再灌注损伤、肾毒性药物和感染是AKI的主要原因。炎症反应是AKI的重要表现，同时也是导致组织损伤的重要原因。受损组织及活性氧等募集炎性细胞浸入，同时分泌TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6等炎性因子，而炎性因子可进一步募集白细胞渗入，导致肾组织损伤加重以及肾功能减退，因此抑制炎性细胞聚集及细胞因子释放对减轻AKI损伤具有重要意义。其中，巨噬细胞是AKI的关键参与者。虽然剔除巨噬细胞可减弱AKI带来的肾损伤，但是直接剔除巨噬细胞导致肾脏修复过程延缓，可能不是AKI的最佳治疗方案[11，13-17]。因此，研究巨噬细胞介导AKI的病理生理进展的分子机制是制定AKI新治疗策略的必要条件。MIF是由巨噬细胞分泌的位于炎症反应上游的调节因子[18]。我们的前期研究显示MIF在AKI小鼠肾组织中高表达，全身性MIF基因敲除或MIF药理学阻断对小鼠AKI有保护作用，MIF缺失后AKI小鼠的肾功能改善，巨噬细胞浸润和炎性细胞因子释放大幅减少[11-12]。

为了探究MIF依赖性巨噬细胞对顺铂诱导的AKI的影响，我们在AKI造模6h后将MIF+/+或MIF-/-巨噬细胞注射到小鼠体内，并在注射后第3日分别分析肾脏病理、功能和肾脏中的巨噬细胞浸润情况等，结果显示在顺铂诱导的AKI发展过程中MIF通过增强M1型巨噬细胞活化加重AKI。促炎因子（如TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6等）在肾组织中的过量生成与AKI的发病机制有关。本研究在Cis-AKI小鼠模型中发现，与MIF-/-巨噬细胞组小鼠相比，巨噬细胞对照组小鼠的炎性细胞因子如MCP-1和TNF-α表达增高，肾小管损伤和血清肌酐升高更严重，提示巨噬细胞通过促进肾组织炎性反应进而加重AKI是MIF依赖性的，证实了MIF依赖性巨噬细胞在AKI中的致病作用。Mincle是M1型巨噬细胞激活的关键因素[3]。坏死肾小管细胞中的β-葡萄糖神经酰胺可以通过Mincle激活巨噬细胞，诱导小鼠AKI后的持续炎症[19]。MIF-/-巨噬细胞组小鼠肾脏Mincle+M1型巨噬细胞的比例较巨噬细胞对照组低，提示MIF能通过增强巨噬细胞中Mincle的表达促进AKI肾小管损伤阶段M1型巨噬细胞的活化。这些结果表明，MIF通过促进巨噬细胞活化，进一步增加了炎性细胞因子的产生，在很大程度上加剧了AKI。

综上所述，MIF依赖的巨噬细胞通过促进肾脏M1型巨噬细胞表面Mincle激活，增加促炎因子表达，加重AKI介导的肾脏结构和功能损伤。后续我们将进一步在小鼠巨噬细胞中特异性敲除MIF来验证MIF对巨噬细胞的调控机制，探讨可能的AKI治疗靶点。