党参地上茎叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性

唐文文 陈垣

摘要：以党参废弃物茎叶为试验材料，在单因素试验基础上，设计Box-Behnken响应面试验，优化双酶协同超声波提取党参茎叶总黄酮的最佳提取工艺，采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和 FRAP法评价党参茎叶总黄酮的抗氧化活性。结果表明，利用双酶协同超声法提取党参茎叶总黄酮的最佳条件为：液料比40 mL ∶1 g，乙醇体积分数70%，双酶（纤维素酶 ∶果胶酶=1 ∶1）用量0.45 mg/mL，酶解时间60 min，超声时间42 min，此条件下，总黄酮提取率为6.511%。DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP总还原力的分析结果表明，党参茎叶总黄酮具有较高的抗氧化活性，在浓度为100 μg/mL时，对DPPH自由基清除率达到91.74%;在浓度达到500 μg/mL时，对ABTS自由基的清除率为94.82%，非常接近维生素C;党参茎叶总黄酮的总还原力为28.22 mg/g。本研究确定出党参茎叶总黄酮具有抗氧化活性，可为党参资源的充分利用提供数据支撑。

关键词：党参茎叶;总黄酮;提取工艺;双酶协同超声法;响应面;抗氧化

中图分类号： R284  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）17-0171-07

收稿日期：2021-06-30

基金项目：国家重点研发专项（编号：2018YFC1706301）;甘肃省现代农业中药材产业体系首席专家项目（编号：GARS-ZYC-1）。

作者简介：唐文文（1986—），女，河南许昌人，硕士，副教授，主要从事药用植物资源开发与利用研究。E-mail：412251544@qq.com。

通信作者：陈 垣，博士，教授，主要从事药用植物资源开发与利用研究。E-mail：chenyuan@gsau.edu.cn。

党参[Codonopsis pilosula  （Franch.） Nannf.]为桔梗科多年生草本植物，始载于《本草从新》，是传统的补中益气类中药材，也是药食两用大宗中药材[1-2]。《中国药典》规定党参的药用部位为根[3]，在主产区为方便采挖根部，需先割掉其地上部分，在种植区调研发现，党参生长期内其地上部分的生物量远大于根部，为促进根部生长，会在生长中期对其进行“打尖割蔓”，其地上部分茎叶多数被弃于田间路旁。随着人们健康意识的提高，党参需求量倍增，近年来党参年均种植面积均在3.3万hm2以上，大量的党参茎叶被丢弃，浪费资源的同时又造成产地环境污染。有学者对党参地上部分的化学成分进行研究，但大多集中在多糖和皂苷上[4-6]，對其黄酮类化合物的研究较少，黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、保肝、抗癌、抗炎等药理活性[7]，并且植物源黄酮类化合物具天然低毒的特点，在开发高效安全的天然药物、护肤品、保健品等方面具有广阔前景。目前尚未见对党参地上部分茎叶黄酮类提取工艺和生物活性的研究，因此本试验采用双酶法协同超声波提取党参地上部分茎叶的总黄酮，再通过Box-Behnken响应面法优化其提取工艺，并测定其抗氧化活性，为党参资源的充分合理利用及其非药用部位的药理活性研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料、仪器与试剂

试验用党参茎叶，于2020年9月中旬采于甘肃省渭源县，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为桔梗科植物党参[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]地上部分茎叶，将地上部分茎、叶分离，去杂质，45 ℃烘干，备用。

UV-1801紫外可见分光光度计，购自北京瑞丽分析仪器公司;SB5200DTD 超声波清洗机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司;CP214电子天平，购自奥豪斯仪器（上海）有限公司;New Human Power型超纯水仪，购自韩国Human公司;芸香苷（批号为B20771，纯度≥98%），购自上海源叶生物科技有限公司;DPPH、ABTS，购自Sigma试剂公司;纤维素酶、果胶酶均为食品级，购自南宁庞博生物有限公司;乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 党参茎叶总黄酮的提取 精确称取党参茎叶（茎 ∶叶=1 ∶1）粉末2.0 g，过四号筛，置于具塞三角瓶中，按不同液料比加入不同浓度的乙醇水溶液，密塞摇匀，调节溶液pH值为4.5，按照纤维素酶 ∶果胶酶=1 ∶1的比例加入不同量的双酶，放入 40 ℃ 水浴锅中保温酶解反应一定时间，取出，50 ℃、250 W超声一定时间，摇匀，4 000 r/min离心10 min，精确量取上清液5 mL，定容至10 mL容量瓶中，得党参茎叶总黄酮提取液。

1.2.2 党参茎叶总黄酮含量的测定  参考陈蓬凤等的方法[8]，以芸香苷为对照品，绘制标准曲线，以吸光度D为纵坐标，芸香苷浓度C为横坐标，得线性回归方程为D=10.003C+0.000 7（r2=0.999 3），芸香苷对照品质量浓度的线性范围为0.015～0.75 mg/mL。按照下式计算党参茎叶总黄酮提取率（x）。

x=（C1×V×n）/m×100%。

式中：C1为标准曲线中计算出的总黄酮浓度，mg/mL;V为提取液体积，mL;n为稀释倍数;m为取样量，g。

1.2.3 单因素试验设计 精确称取党参茎叶粉末2.0 g，其他提取条件保持一致，分别固定液料比 40 mL ∶1 g、乙醇体积分数40%，超声时间40 min、双酶（维素酶 ∶果胶酶=1 ∶1）用量0.4 mg/mL、酶解时间60 min等因素中的4个，考察其余各因素对党参茎叶总黄酮提取率的影响。试验设计见表1。

1.2.4 Box-Behnken响应面试验设计 在“1.2.3”节单因素试验的基础上，对单因素试验结果进行分析后，选取对总黄酮提取率影响较大的因素为独立变量，以党参茎叶总黄酮提取率为响应值，设计响应面试验。

1.2.5 抗氧化活性测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力测定 将DPPH配制成浓度为0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，参考Dong等的测定方法[9]，将党参茎叶总黄酮配成不同浓度的溶液，分别取所配溶液各2 mL，均加入 2.0 mL DPPH乙醇溶液，快速混匀，于室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度，以乙醇为空白对照，以维生素C为阳性对照。样品对DPPH自由基清除率用下述方程计算：

y=[D0-（Ds-Ds0）]/D0×100%。

式中：y为DPPH自由基清除率，%;D0为空白组的吸光度;Ds为不同样品吸光度;Ds0为样品自身吸光度。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力测定 参考de Souza等的方法[10]，将5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和5 mL 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合摇匀，室温中避光静置12 h，使用前，用乙醇稀释至吸光度为0.70±0.02 （734 nm 波长下）的ABTS+工作液，取不同浓度的样品溶液50 μL加入2 mL ABTS+工作液，充分混合，室温避光反应6 min，于734 nm处测吸光度，以乙醇为空白对照，以维生素C为阳性对照。样品对ABTS自由基清除率用下述方程计算：

T=（1-Ds/D0） ×100%。

式中：T为ABTS自由基清除率，%;D0为空白组的吸光度;Ds为不同样品吸光度。

1.2.5.3 FRAP总还原力的测定 参考Jin等的方法[11]，取浓度为0.2 mg/mL的党参茎叶总黄酮溶液0.5 mL于10 mL具塞比色管中，加入4 mL FRAP工作液（现用现配），充分混匀，37 ℃水浴30 min后，593 nm 处测定反应液的吸光度。以不同浓度的VC系列溶液绘制标准曲线（y=6.823x+0.040 5， r2=0.997 6），以1 g样品中VC相当含量表示样品的总还原能力（mg/g）。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，Excel 2010和SPSS 20.0 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

如图1-A所示，在液料比为10～40 mL ∶1 g范围内时，随着液料比增加，总黄酮的提取率逐渐升高，主要是由于伴随着溶剂比例的提高，增大了党参茎叶粉末与提取溶剂的接触面积，促进黄酮类化合物的溶出，當液料比达到40 mL ∶1 g时，提取率达到最大;继续增大液料比，提取率略微下降，可能是由于溶剂比例过大会增加提取过程中的损耗。因此本试验选择40 mL ∶1 g为最佳液料比。

如图1-B所示，乙醇体积分数在40%～70%范围内时，随着体积分数增加，总黄酮提取率逐渐增大，当乙醇体积分数达到70%时，提取率达到最大值;继续增加乙醇体积分数，提取率下降。可能是由于党参茎叶中所含黄酮类化合物既有游离黄酮又有可溶于水的黄酮苷类物质，且游离黄酮占比较大，乙醇体积分数过低造成游离黄酮苷元不能充分溶出，体积分数过高又会影响极性较大的黄酮苷类物质溶出。因此本研究选择60%、70%、80%进行响应面优化试验。

如图1-C所示，超声时间对党参茎叶总黄酮的提取率影响较大，超声提取时间在40 min内时，随着时间的延长，总黄酮提取率增加，在40 min时提取率达到最大;此时继续增加超声提取时间，不仅未使提取率进一步提高，反而有所降低。可能因为超声时间过短，植物细胞壁不能被充分破坏，阻碍了有效成分的溶出;而超声时间过长，一部分黄酮类物质在超声波的空化作用及机械效应下结构发生改变。因此，本研究选择30、40、50 min进行响应面优化试验。

如图1-D所示，双酶用量对的提取率影响较大，未加酶处理的总黄酮提取率远低于加酶处理，可能由于党参茎秆中纤维素类和果胶类含量较多，影响活性成分的溶出，纤维素酶和果胶酶能够分解植物细胞壁中的纤维素和果胶，从而加快破坏细胞壁的速度。在双酶用量为0.4 mg/mL时，党参茎叶总黄酮提取率最高，因此本研究选择酶用量0.3、0.4、0.5 mg/mL进行响应面优化试验。

如图1-E所示，当酶解时间在60 min之内时，总黄酮提取率随酶解时间延长而升高，并且升高较快，60 min 以后提取率趋于平缓。酶解时间过短，纤维素酶和果胶酶不能充分破坏原料的细胞壁，随着酶解时间延长，纤维素和果胶已被降解完全，过长的酶促反应时间可能还会破坏黄酮的结构，从节约时间和保证纯度考虑，确定酶解反应时间为60 min。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素试验结果，固定液料比为40 mL ∶1 g、酶解时间为60 min条件下，选取乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、双酶用量（C）等3个因素为变量，以党参茎叶总黄酮提取率（x）为响应值，采用Box-Behnken法设计3因素3水平响应面试验，试验设计见表2，响应面试验结果见表3。使用 Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行二次响应面回归分析，得到如下多元二次回归方程：

x=6.55+0.20A+0.057B+0.087C-0.046AB-0.050AC+0.000 5BC-0.57A2-0.13B2-0.073C2。

由表4可知，该模型显著性检验的P值<0.000 1，表明该模型具有统计学意义。失拟项的P值为0.321 1>0.05，调整系数R2adj=0.985 1，变异系数CV为0.69%，说明回归模型拟合较好，能较准确反映3个因素对党参茎叶总黄酮提取率的影响。从F值可以看出各因素对党参茎叶总黄酮提取率的影响大小：乙醇体积分数>双酶用量>超声时间。

2.2.2 方差和交互作用分析 从表4方差来源中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2和C2的P值分别为<0.000 1、0.007 0、0.000 7、<0.000 1、0.000 4、0.010 2，表明A、B、C等3个因素对党参茎叶总黄酮提取率有极显著影响（P<0.01），且乙醇体积分数的影响最大，这在图2各因素两两交互作用的3D响应面图曲线坡度陡峭程度上得到了验证，乙醇体积分数的曲面最为陡峭;另外乙醇体积分数和双酶用量、乙醇体积分数和超声时间均有一定的交互作用，而超声时间和双酶用量的等高线为圆形，3D响应面几乎无曲度，说明二者几乎无交互作用。

2.2.3 最优提取条件的确定及验证 根据响应面分析得到最优提取条件为：乙醇体积分数71.38%，

超声时间41.93 min，双酶用量0.45 mg/mL，此条件下党参茎叶总黄酮的提取率理论值可达6.597%。考虑到实际可操作性，最佳提取条件优化为：液料比40 mL ∶1 g，乙醇体积分数70%，双酶用量 0.45 mg/mL，酶解时间60 min，超声时间42 min，得到实际提取率为6.511%，与理论值相差0.086百分点。说明此模型预测较好且稳定，可用于党参茎叶中总黄酮的提取。

2.3 党参茎叶总黄酮抗氧化能力评价

自由基对人体正常细胞的攻击与摧毁，是引起人类衰老和患病的主要原因，抗氧化剂通过清除自由基在保证人体健康中起着至关重要的作用。黄酮类化合物除了直接捕捉或络合自由基外，还可通过激活机体的抗氧化系统来发挥抗氧化作用[12]，从而减少机体的氧化损伤。本研究采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法评价党参茎叶总黄酮的抗氧化活性。

如图3和图4所示，党参茎叶总黄酮有较强的DPPH自由基清除能力， 在浓度为10～80 μg/mL时，清除率随着浓度的升高而快速增大;在浓度为100 μg/mL时，清除率达到91.74%，略低于VC。党参茎叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力与DPPH走势相似，在50～400 μg/mL范围内，清除率增大较快;在浓度达到500 μg/mL时，对ABTS清除率为94.82%，非常接近VC。

黨参茎叶总黄酮清除DPPH、ABTS的半抑制浓度（IC50）以及FRAP总还原力分析结果见表5，IC50越小，清除自由基能力越强。由表5可知，ABTS自由基的IC50为DPPH自由基的近7倍，说明党参茎叶总黄酮对DPPH自由基具有更强的清除能力。铁离子的总还原力用来确定各样品是否具有潜在的抗氧化活性。用维生素C建立的标准曲线进行换算，以 1 g 样品中维生素C相当含量表示其抗氧化能力，如表5所示，党参茎叶总黄酮的总还原力为28.22 mg/g。以上DPPH自由基、ABTS自由基和总还原力测定结果表明，党参茎叶具有较强的抗氧化活性。另外本研究还表明，党参茎叶总黄酮对DPPH自由基、ABTS自由基清除力与FRAP总还原力存在一定的差异性，可能与其成分含量和组成不同以及不同的抗氧化体系考察的抗氧化活性的不同方面有关。

3 结论

本研究采用双酶协同超声法对党参茎叶总黄酮进行提取，集合了超声波和酶2种提取方法的优点，通过超声波的振动使细胞壁软化破碎，纤维素酶和果胶酶的加入能够分解那些阻止有效成分溶出的纤维和果胶，使黄酮类成分更易溶出[13-14]。通过单因素和Box-Behnken响应面试验，确定党参茎叶总黄酮的最佳提取条件为：液料比40 mL ∶1 g，乙醇体积分数70%，双酶用量0.45 mg/mL，酶解时间 60 min，超声时间42 min，得到实际提取率为6.511%，与理论值的相差0.086百分点，说明此模型预测较好且稳定，可用于党参茎叶中总黄酮的提取;通过清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法的抗氧化结果明确了党参茎叶总黄酮有较强的抗氧化活性。有研究表明，党参茎叶的毒性小，安全使用范围大[15]，因此党参茎叶一方面可以作为提取天然抗氧化剂的原料，另一方面可用于食品保健品、护肤品的开发提取原料以及作为饲料添加剂使用。

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