脓毒症休克患者血清Kal、VE-Cad的变化及与预后的关系*

吴微华，俞振飞，程抗，安鹏，张伟，陈雲，叶肖琳

（1.杭州市丁桥医院 重症医学科，浙江 杭州310021；2.浙江中医药大学附属第二医院重症医学科，浙江 杭州310005）

脓毒症休克是重症监护病房（ICU）患者死亡的主要原因，具有发病急、进展快、病死率高等特点，由于脓毒症休克临床表现错综复杂，因此准确评估脓毒症休克患者的病变严重程度及预后，对降低病死率具有重要意义[1]。人源性激肽释放酶结合蛋白（Kallistatin, Kal）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人类组织和体液中广泛分布，具有抗炎、抗肿瘤、抗血管生成、抗氧化应激和抗凋亡等作用，参与炎症、高血压、心肌梗死、肿瘤、纤维化、血管生成等多种疾病的病理生理学过程，有研究显示Kal 在肺炎[2]、血管炎[3]、骨关节炎[4]等多种疾病中发挥抗炎作用，然而，血清Kal 作为评估脓毒症休克患者预后的生物标志物的临床价值仍有待阐明。脓毒症休克的核心病理过程是炎症和氧化应激导致血管内皮损伤、毛细血管渗漏，血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin, VE-cad）是血管内皮细胞之间黏附连接的特异性钙黏蛋白，在维持血管内皮细胞极性和完整性等方面具有重要作用[5]，但血清VE-cad 的表达与脓毒症休克患者疾病严重程度及预后的研究尚不多见。本研究通过检测不同预后脓毒症休克患者血清Kal、VE-cad 水平变化，分析Kal、VE-cad 与急性生理学及慢性健康状况Ⅱ（APACHE Ⅱ）评分和序贯器官功能衰竭估计（SOFA）评分的相关性，旨在探讨两者对脓毒症休克患者预后评估的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2016年3月—2018年3月杭州市丁桥医院重症医学科收治的脓毒症休克患者252例。纳入标准：①临床资料完整；②符合“脓毒症3.0 指南”的诊断标准[6]；③年龄≥18 岁；④住院时间＞1 d；⑤患者或家属知情同意并签署同意书。排除标准：①妊娠；②中枢神经系统或严重免疫缺陷；③心力衰竭；④慢性肝肾疾病终末期、肿瘤晚期；⑤既往存在烟草、酒精或毒品依赖；⑥临床资料不完整；⑦依从性差。最终纳入研究的患者为178例。本研究经杭州市中医院伦理委员会批准。根据患者28 d预后，分为存活组120例和死亡组58例。两组年龄、性别、感染类型、病原学情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂

Sysmex XT-4000i 全自动五分类血细胞分析仪购自日本希森美康株式会社，BS-600 全自动生化分析仪购自中国深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，OTTOMAN 全自动特定蛋白即时检测分析仪购自中国武汉锦之琪医疗器械有限公司，VITROS5600 全自动生化免疫分析仪购自美国强生公司。酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国R&D systems 公司，“三明治免疫夹心法”检测试剂盒购自美国Abcam 公司。

1.3 方法

采集患者入院24 h 内外周静脉血5 ml，2 管分装，其中一管注入EDTA 抗凝试管，不经离心处理，置于-20℃冰箱保存，采用Sysmex XT-4000i 全自动五分类血细胞分析仪检测白细胞（WBC）水平，另一管经3 000 r/min 离心5 min，取上清液，置于-20℃冰箱保存，采用BS-600 全自动生化分析仪检测血清白蛋白（ALB）水平；采集患者入ICU 第1 天、第3 天、第5 天的外周静脉血5 ml，3 000 r/min 离心5 min，取上清液，置于-20℃冰箱保存，采用OTTOMAN 全自动特定蛋白即时检测分析仪检测血清C 反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）水平；采用ELISA 法检测血清Kal 水平，采用“三明治免疫夹心法”检测血清VE-cad 水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 脓毒症休克患者治疗措施及观察指标

积极液体复苏、抗感染、肺保护性机械通气、血管活性药物和控制血糖等，血管活性药物多巴胺初始剂量为1 μg/（kg·min）、逐渐增加剂量≤20 μg/（kg·min），去甲肾上腺素初始剂量为0.05 μg/（kg·min）、逐渐增加剂量≤0.5 μg/（kg·min）[7]。收集患者的姓名、年龄、性别、机械通气时间、感染类型、ICU住院时间。入院24 h内行PICCO监测，当日指标为每天3次测量的平均值，并记录血管外肺水指数（EVLWI）及其他血流动力学指标，连续监测5 d 或患者死亡。患者入院24 h内采集外周静脉血进行血培养并检测病原学情况，同时对患者进行APACHEⅡ评分[8]及SOFA 评分[9]。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较做t检验或重复测量设计的方差分析；计数资料以构成比或率（%）表示，比较采用χ2检验；相关分析用Pearson 法，绘制ROC 曲线，采用Logistic 回归分析脓毒症休克死亡的危险因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床指标的比较

两组性别、年龄、感染部位、病原学、WBC比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组CRP、PCT、氧合指数、EVLWI、ALB、机械通气时间、ICU 住院时间、APACHEⅡ评分及SOFA 评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），死亡组的氧合指数和ALB 低于存活组，机械通气时间、ICU 住院时间长于存活组，CRP、PCT、EVLWI、APACHEⅡ评分和SOFA 评分高于存活组。见表1。

表1 两组临床指标的比较

2.2 两组血清Kal、VE-cad水平比较

两组入住ICU 第1 天、第3 天、第5 天血清Kal、VE-cad 水平比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：不同时间点的血清Kal、VE-cad 水平有差异（F=185.920 和308.918，均P=0.000）；两组血清Kal、VE-cad 水平有差异（F=456.521 和535.773，均P=0.000），死亡组血清Kal 水平均低于存活组，死亡组血清VE-cad 水平均高于存活组；两组血清Kal、VE-cad 水平变化趋势有差异（F=24.068 和3.965，P=0.000 和0.047）。见表2 和图1。

表2 两组血清Kal、VE-cad水平的比较 （x±s）

图1 存活组和死亡组血清Kal、VE-cad水平的不同时间点变化趋势

2.3 血清Kal、VE-cad与APACHEⅡ评分和SOFA评分的相关性

血清Kal 与APACHE Ⅱ评分和SOFA 评分呈负相关（P＜0.05）；血清VE-cad 与APACHEⅡ评分和SOFA 评分呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表3 血清Kal、VE-cad与APACHEⅡ评分和SOFA评分的相关性

2.4 入院24 h 内血清Kal、VE-cad 单独及联合检测对脓毒症休克患者死亡的预测价值

入院24 h 内血清Kal、VE-cad 单独与两者联合检测的曲线下面积（AUC）分别为0.687（95%CI：0.604，0.770）、0.859（95%CI：0.805，0.912）、0.890（95%CI：0.845，0.936）。血清Kal 检测预测脓毒症休克患者死亡的敏感性为81.0%（95%CI：0.772，0.854），特异性为50.0%（95%CI：0.474，0.531）；VE-cad 检测预测脓毒症休克患者死亡的敏感性为69.0%（95%CI：0.649，0.726），特异性为86.7%（95%CI：0.822，0.914）；血清Kal 和VE-cad 联合检测预测脓毒症休克患者死亡的敏感性为82.2%（95%CI：0.781，0.868），特异性为89.6%（95%CI：0.852，0.954）。见表4 和图2。

表4 Kal、VE-cad单独及联合检测对脓毒症休克患者死亡的预测价值

图2 Kal、VE-cad单独及联合检测判断脓毒症休克预后的ROC曲线

2.5 脓毒症休克患者死亡的影响因素

以脓毒症休克患者28 d 预后状况为因变量（1=死亡，0=存活），以表1、2 中有统计学意义的因素为自变量，建立非条件Logistic 回归模型。初选11 个指标作为自变量，考虑到阳性样本量较少，将由患者病情严重程度引起的4 个关联指标（机械通气时间、ICU 住院时间、APACHE Ⅱ评分及SOFA 评分）剔除，实际纳入7 个自变量。回归过程采用逐步后退法，α入=0.05，α出=0.10。结果：CRP[=1.221（95% CI：1.022，1.459）]、PCT[ O^ R=1.195（95% CI：1.035，1.380）]、VE-cad[=1.373（95% CI：1.055，1.787）]、EVLWI[=1.846（95% CI：1.178，2.893）]是脓毒症休克患者死亡的危险因素，Kal[=0.428（95CI%：0.190，0.966）]是脓毒症休克患者死亡的保护因素。见表5。

表5 脓毒症休克死亡的二元Logistic回归分析参数

3 讨论

脓毒症是一种危及生命器官功能障碍综合征，是因宿主对感染的反应失调而引起，脓毒症休克是一种更为严重的危及生命的脓毒症类型，尽管对脓毒症休克的发病机制和治疗的认识不断进步，但其死亡率仍然很高[10-11]。内皮细胞活化是一种对感染的正常适应性反应，内皮功能障碍是脓毒症和脓毒症休克的重要病理生理过程之一，其特征是血管通透性增加、血管舒缩张力改变、细胞黏附、凝血和内皮细胞凋亡得到促进，在脓毒症的发生发展过程中，内皮细胞功能失调导致血管张力明显降低，微血管弥散性改变、通透性增加和弥散性血管内凝血[12]。现有临床研究显示，许多生物标志物与内皮功能障碍有关[13]，并且用于评估血管内皮活性的血清生物标志物与脓毒症疾病严重程度和预后密切相关[14]。

Kal 是一种激肽释放酶结合蛋白，目前已知其具有多种功能，包括抗炎、抗肿瘤、抗血管生成、抗氧化应激和抗凋亡等作用[15]。研究显示Kal 作为脓毒症、社区获得性肺炎、急性胰腺炎、血管和器官损伤、主动脉瘤等疾病的新型血清分子标志物具有广阔前景[16-17]。Kal 对脓毒症休克患者器官保护的可能机制如下：诱导内皮型一氧化氮合酶的合成，抑制促炎因子如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll样受体4（TLR4）、血管黏附因子-1 和细胞内黏附分子-1 的表达，抑制核因子-κB（NF-κB）激活，抑制Caspase-3 活性和凋亡[18]。血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bEGF）是血管新生的重要分子，Kal 可与VEGF、bEGF 竞争性结合其内皮细胞表面的乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）受体从而阻断血管生成信号通路[19]。LIN 等[20]研究显示血清Kal 水平在脓毒症休克合并社区获得性肺炎患者表达较低。LI 等[17]体内研究显示，外源性Kal明显减轻脓毒症造模大鼠的炎症反应、器官损伤，并且可有效降低模型大鼠的病死率。王宏斌等[21]研究显示脓毒症休克患者死亡组血清Kal 水平低于存活组，Kal 水平与脓毒症休克、APACHEⅡ评分、SOFA 评分及CRP 水平呈负相关。本研究结果显示，死亡组血清Kal 水平低于存活组，且脓毒症休克患者血清Kal 水平与APACHEⅡ评分和SOFA 评分呈负相关；ROC 曲线分析显示，当血清Kal 水平到达临界值3.862 μg/ml 时，其预测脓毒症休克患者死亡的敏感性为81.0%，特异性为50.0%，表明血清Kal 预测脓毒症休克患者死亡的敏感性较高，但特异性较差。本研究进一步采用Logistic 回归分析结果显示Kal 水平高是影响脓毒症休克患者死亡的保护因素。王宏斌等[21]研究显示Kal 水平低是脓毒症休克和严重脓毒症患者预后的危险因素。LIN 等[20]研究显示，脓毒症休克合并社区获得性肺炎患者第1 天Kal 水平越高，死亡的风险越低，因此他们认为Kal 水平可以作为脓毒症休克合并社区获得性肺炎患者病情严重程度的预测标志物，这可能与Kal 本身具有抗炎和抗凝作用有关，当然Kal 能否作为诊断标志物仍需大量临床研究进一步证实。

VE-cad 在维持血管内皮屏障完整性方面发挥着重要作用，在脓毒症的发生发展过程中，其水平不断升高[22-23]。本研究显示，死亡组血清VE-cad 水平较存活组高，并且持续保持较高水平，而存活组血清VE-cad 水平逐渐降至正常水平，表明血管内皮屏障遭到破坏，并且脓毒症休克组血清VE-cad 水平与APACHEⅡ评分和SOFA 评分呈正相关，ROC 曲线分析显示，当血清VE-cad 水平到达临界值3.350 ng/ml时，其预测脓毒症休克患者死亡的敏感性为69.0%，特异性为86.7%，表明血清VE-cad 预测脓毒症休克患者死亡的特异性较高，但敏感性较差。但两者联合检测时其敏感性和特异性分别为82.2%和89.6%，说明联合检测对评估脓毒症休克患者的预后具有较高的预测价值，因此两者的联合检测可能作为临床评估脓毒症休克患者预后的重要手段。

本研究亦发现，死亡组ALB 水平、氧合指数均低于存活组，而机械通气时间、ICU 住院天数长于存活组，EVLWI 水平高于存活组，并且VE-cad、EVLWI 是影响脓毒症休克患者死亡的危险因素。其可能机制如下：在炎症和氧化应激刺激下，VE-cad与连环蛋白连接遭到破坏，血管内皮屏障遭到破坏，血液中的白蛋白渗漏到组织间隙，导致ALB 水平下降，而ALB 水平降低可致肺水肿，进而影响肺换气弥散功能，导致氧合指数降低，EVLWI 升高，死亡组血清VE-cad 升高，表明严重的血管屏障受损使液体正平衡被促发，而液体正平衡是影响该疾病患者死亡的独立危险因素[24-25]。液体正平衡可使心脏前负荷增加，影响VE-cad 与血管内皮细胞之间的紧密连接，使细胞连接张力下降，导致血管内皮细胞间形成出现缝隙[26]。由于VE-cad 在维持内皮屏障完整性中的重要意义，目前已有研究认为VE-cad可能作为血管内皮屏障修复的靶标[27]。

综上所述，CRP、PCT、Kal、VE-cad、EVLWI均是脓毒症休克患者死亡的影响因素，研究脓毒症休克患者血清中Kal、VE-Cad 水平变化有助于评估疾病预后，并且两者作为新型血清分子标志物具有广阔的应用前景。