基质金属蛋白酶-2和血管内皮生长因子在食管鳞癌中的表达及其与预后的关系

张文宇

(郑州市第九人民医院 心胸外科，河南 郑州 450000)

肿瘤细胞转移、浸润是恶性肿瘤患者的主要死因，其中肿瘤微血管生成在其中扮演较为重要的角色[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促进肿瘤细胞的播散、转移，促进肿瘤血管新生[2-3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)-2可降解间质内基质成分，从而诱导肿瘤细胞侵袭周围组织，还可促进机体形成肿瘤微血管，加快血行转移[4-5]。本研究主要探讨食管鳞癌患者癌组织中MMP-2、VEGF的表达水平及其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2015年1月至2016年2月在郑州市第九人民医院接受治疗的146例食管鳞癌患者的癌组织(试验组)及同期在郑州市第九人民医院体检正常的60例健康者的食管组织(对照组)作为研究对象。纳入标准：(1)鳞癌组织经病理学证实确诊为食管鳞癌；(2)自愿参与本研究并签署知情同意书；(3)临床资料完善。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)经化疗及生物治疗；(3)不配合随访。试验组年龄45～73岁，平均(60.12±3.45)岁；男86例，女60例；分化程度中低分化68例，高分化78例；淋巴结转移57例，无淋巴结转移89例；浸润程度pT1～pT2期76例，pT3期46例，pT4期24例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期45例，Ⅲ期61例，Ⅳ期19例。对照组年龄42～75岁，平均(59.42±3.51)岁；男33例，女27例。两组患者年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经郑州市第九人民医院医学伦理委员会审核批准通过。

1.2 实验试剂上海煊翎生物技术有限公司的兔抗人MMP-2抗体，上海浩然生物科技有限公司的兔抗人VEGF抗体，上海沪震实业有限公司的DAB显色试剂盒及免疫组化SP染色试剂盒。

1.3 实验方法以免疫组化法进行染色，将标本进行石蜡包埋，切成4 μm切片，经脱蜡、水化、高压修复后将一抗(1∶100稀释)加入，再孵育过夜(4 ℃)，在室温下加入二抗孵育20 min，再将辣根过氧化物酶加入，DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片以后，可在显微镜下观察。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，阳性片为阳性对照。

1.4 判定结果以双盲法判定结果，由两位经验丰富的病理科医生进行切片观察后判定，以半定量评分法作为判定标准。按照阳性细胞占比计分：阴性为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，超过75%为4分。染色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞数评分及染色强度评分乘积为判断标准，4分及以上为阳性，否则为阴性。

1.5 观察指标(1)一般资料。收集患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结是否转移、分化程度、TNM分期及浸润程度等资料并进行比较。(2)MMP-2、VEGF表达与临床病理因素的关系。

1.6 随访以电话方式进行为期5 a的随访，截至2021年2月。记录研究对象生存情况，并分析MMP-2、VEGF表达与患者预后的关系。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件处理数据。计数资料以百分比(%)表示，采用χ2检验；MMP-2与VEGF相关性分析采用χ2检验，用COX多因素回归分析分析影响食管鳞癌患者生存期的因素，并以生存曲线表示MMP-2、VEGF表达与生存期的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-2、VEGF在食管鳞癌组织中的表达MMP-2、VEGF在细胞质中呈阳性表达，为棕褐色颗粒。食管鳞癌患者组织中MMP-2阳性率高于正常组织(P<0.05)，VEGF阳性率高于正常组织(P<0.05)。见表1及图1。

表1 MMP-2、VEGF在食管鳞癌组织中的表达[n(%)]

2.2 MMP-2、VEGF阳性表达与食管鳞癌临床病理因素的关系分析146例食管鳞癌组织MMP-2、VEGF阳性表达与临床病理学的关系，结果显示，MMP-2、VEGF阳性表达与食管鳞癌患者TNM分期、分化程度、浸润程度及淋巴结是否转移有关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。见表2。

表2 MMP-2、VEGF阳性表达与食管鳞癌临床病理因素的关系[n(%)]

2.3 MMP-2、VEGF在食管鳞癌组织中表达的相关性本研究146例食管鳞癌患者组织中MMP-2、VEGF表达情况见表3。进一步行相关性检验显示MMP-2、VEGF在食管鳞癌组织中的表达具有相关性(χ2=7.086，P=0.008)。

表3 MMP-2、VEGF在食管鳞癌组织中表达的相关性[n(%)]

2.4 MMP-2、VEGF表达与生存期的关系对146例食管鳞癌患者进行随访，结果显示，MMP-2阳性组生存率为19.23%(15/78)，中位生存期为22个月；阴性组生存率为61.54%(48/78)，中位生存期为32个月，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF阳性组生存率为33.04%(38/115)，中位生存期为21个月；阴性表达组生存率为80.65%(25/31)，中位生存期为34个月，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A为不同MMP-2水平的食管鳞癌患者的生存曲线；B为不同VEGF水平的食管鳞癌患者的生存曲线；MMP-2为基质金属蛋白酶-2；VEGF为血管内皮生长因子。

2.5 影响食管鳞癌患者生存期的多因素分析以MMP-2、VEGF阳性表达为自变量进行COX多因素回归分析。结果显示，MMP-2、VEGF阳性表达为影响食管鳞癌患者生存期的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 COX多因素回归分析影响食管鳞癌生存期的危险因素

3 讨论

食管鳞癌的发生是多步骤、多基因共同参与的缓慢过程，起主导作用的为上皮细胞恶变。间质细胞可分泌多种类型的细胞因子，其中MMPs发挥重要作用[6]。研究显示，MMPs在恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[7-8]。其中MMP-2为MMPs中的明胶酶，以Ⅳ型胶原蛋白、明胶、胶原蛋白(基底膜上变性的)为底物，不仅可将基底膜糖蛋白降解，还在肿瘤形成新生血管过程中发挥重要作用[9-10]。有研究显示，MMP-2主要表达于食管癌细胞薄膜及细胞质内，在转移灶及癌组织中表达水平升高[9,11]。此外，研究发现MMP-2高表达可破坏基底膜使肿瘤细胞较易浸润淋巴管，与乳腺癌组织侵袭能力及分级亦具有相关性[12]。本研究对食管鳞癌患者癌组织及健康者食管组织进行分析，结果显示，MMP-2在食管鳞癌组织中表达水平高于正常组织，这提示MMP-2参与食管鳞癌的发生，与刘朝红等[13]的研究结果一致。另外，MMP-2阳性表达与食管鳞癌患者的TNM分期、分化程度、浸润程度及淋巴结是否转移有关，这可能与MMP-2促进肿瘤形成有关。进一步分析影响食管鳞癌生存期的因素，结果显示，MMP-2为影响食管鳞癌预后的独立危险因素，这与李筱[14]的研究结果一致。

VEGF包括7个内含子、8个外显子，位于染色体6p21.3.，包括VEGF-A、B、C、D。其中VEGF-A可与血管内皮细胞膜上的受体结合，磷酸化底物络氨酸残基，并将信号传导激发，诱导机体内皮细胞增殖，促进内皮细胞迁移，进而促进血管生成，利于恶性肿瘤的转移及进一步发展[1]。VEGF-C可促进机体生成淋巴管，在肿瘤细胞转移、浸润过程中发挥重要作用。研究显示，VEGF在胃癌、结肠癌组织中呈高表达，参与肿瘤的发生、发展[15-16]。本研究结果显示，癌组织中VEGF阳性率高于正常组织，与刘昊等[17-18]研究结果一致，提示VEGF与食管鳞癌的发生密切相关。本研究进一步分析VEGF与病理特征的关系，结果显示，VEGF阳性表达与食管鳞癌患者TNM分期、分化程度、浸润程度及淋巴结是否转移有关，表明VEGF可促进肿瘤细胞的进一步发展，这可能与VEGF能够促进淋巴管及血管生成有关。进行COX多因素分析，结果显示VEGF阳性表达为影响食管鳞癌预后的独立危险因素，这一结果与VEGF在胃癌、结肠癌中的结果类似。另外，本研究还对MMP-2与VEGF的相关性进行了分析，结果表明二者关系密切，但是尚不清楚其具体作用机制。

综上所述，食管鳞癌组织中MMP-2、VEGF均呈阳性表达，且二者具有相关性，其表达水平与TNM分期、分化程度、浸润程度及淋巴结是否转移有关，为影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素，可预测食管鳞癌患者的预后。但本研究尚不清楚二者相关性的具体作用机制，需进一步深入研究。