急性脑梗死患者外周血MIF、TLR4水平与脑水肿严重程度的相关性

宋士更, 韩瑞丽, 王一旻

天津市泰达医院重症医学科(天津 300457)

急性脑梗死(acute cerebral infarction，ACI)是神经内科常见病和多发病，具有高致残率和病死率。ACI患者早期致死的主要原因是脑水肿[1]，其中炎症反应及炎症因子在脑水肿形成的病理生理过程中发挥重要作用[2]。目前有许多评价脑水肿的方法和指标，但基本都存在无法及时测定或使用条件有限的缺陷。因此寻找一种快速、灵敏的指标来评价脑水肿严重程度显得至关重要。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)由T细胞产生，能抑制巨噬细胞自由移动[3-4]。相关研究表明，脑组织中MIF等炎性细胞因子含量的变化对创伤性脑损伤后脑水肿的发生具有一定作用[5]。Toll样受体4(toll-like receptors，TLR4)是TLR家族中的一员，与非特异性免疫及炎症反应有密切联系。研究结果表明，TLR4参与并介导中枢神经系统缺血性损伤过程，通过抑制TLR4介导的神经炎症反应，可改善脑水肿情况[6]。但目前探讨ACI患者外周血MIF、TLR4水平与脑水肿严重程度相关性的研究较少。因此，本研究通过检测ACI患者外周血中MIF、TLR4水平，监测患者患侧CEI扰动系数值，探讨ACI患者外周血MIF、TLR4水平与脑水肿严重程度的相关性，为临床上治疗ACI提供可靠的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月至2019年2月于本院住院治疗的165例ACI患者为研究对象，采用1.5T MRI unit(GE SIANA EX-CITE Ⅱ，USA)对患者进行头颅MRI检查，其中检查序列有T1WI、DWI、T2WI。应用开放源图像处理软件OsiriX中感兴趣区分割功能进行结果处理，经软件自动计算获得脑梗死体积，其中小面积脑梗死(小面积ACI组)(最大直径<1.5 cm)86例，年龄42～83岁，平均(62.96±8.43)岁；男39例，女47例。大面积脑梗死(大面积ACI组)(最大直径≥5 cm)79例，年龄43～85岁，平均(64.23±8.64)岁；男42例，女37例。同期选取72例健康体检者作为对照(对照组)，年龄41～83岁，平均(62.54±9.57)岁；男34例，女39例。3组之间性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：(1)诊断符合脑梗死和脑出血中西医结合诊断标准[7]并经CT或MRI证实；(2)发病前4周内无任何创伤或外科手术史；(3)首次发病，发病后24 h内未经任何治疗入院；(4)入院病程超过8 d，且住院期间无任何并发感染。

排除标准：(1)有明显心肝肾功能不全者；(2)有急慢性炎症、自身免疫性疾病、糖尿病者；(3)患有恶性肿瘤者；(4)入院前4周内服用过免疫抑制剂、炎症抑制药及激素等药物者。

本试验经医院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准。本研究中所有患者均由主治以上医师诊断，所有受试对象及家属均由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，同时签署知情同意书。

查阅门诊及住院病历，收集了解患者及对照组入院前一般资料，包括性别、年龄、美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale，NIHSS)评分、血压、血脂、吸烟、饮酒等。

1.2 主要试剂与仪器 MIF ELISA试剂盒(货号：YM-QP11186)，购自上海远慕生物科技有限公司；RNA提取试剂盒(货号：dp419)，购自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR® Green Mix(货号：Q111-02)，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；miScript SYBR® Green qPCR Kit(货号：218076)，购自德国QIAGEN公司。CFX384实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪，购自美国Bio-Rad公司；BORN-BE无创脑水肿动态监护仪，购自重庆博恩富克医疗设备有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 入选研究对象于发病后第1、3、5、7天清晨抽取空腹外周静脉血样，对照组于清晨抽取空腹外周静脉血样，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80℃保存待测。

1.3.2 外周血中MIF水平测定 采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测3组外周血中MIF水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 外周血中TLR4水平测定 采用qRT-PCR法检测3组外周血中TLR4水平。采用RNA提取试剂盒提取外周血中总RNA，反转录得cDNA。采用qRT-PCR仪对TLR4进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μL：miScript SYBR® Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反应条件：95℃，5 min；95℃、45 s，54.9℃、45 s，30个循环；72℃，10 min。TLR4及内参β-actin的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法对外周血TLR4表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 患侧CEI扰动系数值测定 所有患者均于入院后采用BORN-BE无创脑水肿动态监护仪测定患侧CEI扰动系数值。每天监测两次，每次25 min，共7 d，脑水肿指数每天取两次的平均值。操作步骤严格按照仪器操作指南进行。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组之间性别、年龄、血压、血脂、吸烟、饮酒等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。大面积ACI组NIHSS评分显著高于小面积ACI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组患者一般资料比较

2.2 3组外周血中MIF、TLR4水平比较 第1、3、5、7天时，大面积ACI组外周血中MIF、TLR4水平显著高于小面积ACI组和对照组(P<0.05)；小面积ACI组MIF水平显著高于对照组(P<0.05)；第3、5天时，小面积ACI组外周血中TLR4水平显著高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 3组外周血中MIF、TLR4水平比较

2.3 3组患侧CEI扰动系数值比较 第1、3、5、7天时，大面积ACI组扰动系数均显著高于小面积ACI组(P<0.05)。见表4。

表4 3组患侧CEI扰动系数值比较

2.4 MIF与CEI扰动系数值相关性 小面积ACI组、大面积ACI组在第1、3、5、7天时外周血中MIF与患侧CEI扰动系数值均呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 MIF与CEI扰动系数值相关性

2.5 TLR4与CEI扰动系数值相关性 小面积ACI组、大面积ACI组在第1、3、5、7天时外周血中TLR4与患侧CEI扰动系数值均呈正相关(P<0.05)。见表6。

表6 TLR4与CEI扰动系数值相关性

3 讨论

ACI是临床常见的缺血性脑血管疾病，是早期脑组织发生缺血、缺氧及坏死而引起的脑卒中[8-9]。

ACI患者发生脑水肿，会使水分异常积留于脑组织内，造成神经功能缺损，颅内压上升，进而加重患者病情，甚至危及患者生命，为家庭和社会带来沉重负担[10]。因此准确及时地评价脑水肿严重程度、及时采取合理有效的治疗措施，对降低脑水肿的发生率对ACI患者具有重要意义。

MIF是炎症反应过程中的关键细胞因子，在体内广泛分布，且有多种功能，能作为负反馈调节剂发挥神经内分泌功能，调节糖皮质激素和垂体激素，从而影响脑水肿发生过程中的炎性反应[11]。TLR4是一种在非特异性免疫中发挥重要作用的蛋白质分子，主要分布在小胶质细胞、星形胶质细胞，在脑缺血、脑出血后脑水肿形成的炎症反应中发挥了重要作用[12]。MIF、TLR4参与各类中枢神经系统疾病的发生、发展，在中枢神经系统损伤中发挥重要作用，与ACI患者发生脑水肿有密切联系。原铁等[13]通过观察检测药物对脑出血大鼠TLR4表达的影响，探讨神经保护的可能机制，最终证明天麻钩藤饮通过抑制TLR4表达来保护神经功能并减轻脑水肿，进一步证明TLR4水平与脑水肿密切相关。脑水肿监护的主要技术参数为电阻抗扰动系数，正常人扰动系数值一般在7左右，升高时表示脑水肿形成。本研究结果显示，ACI患者电阻扰动系数值早期逐渐升高，到第5天达到高峰值，第7天开始逐步降低，反映了脑梗死患者脑水肿的形成过程。除此之外，研究结果显示在第1、3、5、7天时，大面积ACI组扰动系数均显著高于小面积ACI组，提示脑梗死体积越大，患侧CEI扰动系数值越大，脑水肿也越严重。ACI患者外周血中MIF、TLR4水平变化与患侧CEI扰动系数值的波动一致，且小面积ACI组、大面积ACI组在第1、3、5、7天时外周血中MIF、TLR4与患侧CEI扰动系数值均呈正相关，即两者水平与脑水肿严重程度呈正相关。分析MIF、TLR4诱发脑水肿可能的作用机制为：损伤了患者血-脑屏障，使其通透性增加，从而引发脑水肿；激活补体进而产生大量组胺，引发血管通透性增加，同时促使钙离子向细胞内弥散，进而引发脑水肿。提示MIF、TLR4可作为诊断ACI患者脑水肿早期严重程度的辅助性指标，临床上可通过密切监测外周血中MIF、TLR4水平变化，及时采取合理、有效的治疗措施，降低脑水肿发病率及患者病死率外周血中MIF、TLR4。

在本研究一般资料中，3组之间性别、年龄、血压、血脂、吸烟、饮酒等方面比较，差异均无统计学意义；大面积ACI组NIHSS评分显著高于小面积ACI组。NIHSS评分是一种临床上评价ACI患者神经功能缺损的量表，是临床诊治及评估ACI的重要评分依据[14]。本研究中表明NIHSS评分随脑梗死体积增大而升高，提示随脑梗死体积增大，患者神经功能缺损严重。

综上所述，ACI患者外周血MIF、TLR4水平与脑水肿严重程度呈正相关，MIF、TLR4水平的变化对脑水肿的病情发展有重要意义。临床上应密切监测ACI患者MIF、TLR4水平的变化，采取合理有效的治疗措施，降低ACI患者病死率。但本研究为回顾性研究，样本资料的准确性和完整性受记录水平影响，且MIF、TLR4影响脑水肿的具体作用机制有待深入研究。