8周有氧和抗阻运动对糖尿病大鼠心肌钙代谢及左室舒张功能的影响

2021-09-24江玲玲高德润杨光红李顺昌尚画雨苏全生

中国运动医学杂志 2021年6期

江玲玲高德润杨光红李顺昌尚画雨苏全生

1 成都体育学院运动医学与健康研究所（成都610041）

2 南京医科大学康达学院（江苏连云港222000）

3 成都体育学院运动医学与健康学院（成都610041）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是世界范围内最主要的公共健康问题之一[1]。2017年全球DM 患者人数已达4.25 亿，预测至2045年可能突破6.29 亿[2]。DM是由于先天遗传和后天环境（如肥胖、久坐等）因素相互作用引起的代谢综合征，易诱发多种并发症（如大血管、微血管病变和神经系统病变等）[3-5]。长期处于高血糖状态不仅引起血管损伤，还可累及心肌组织，诱发糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）。随着病程的迁延，其可能引起心肌适应性降低，呈现心脏收缩和舒张功能障碍，最终导致心力衰竭[6]。研究证实，由DM并发的心血管疾病死亡率约65%，其风险等同于冠心病[7]。

心肌肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）是心肌储存Ca2+的部位，其对Ca2+流动性的调控直接影响心脏收缩与舒张活动。在心脏活动周期中，Ca2+在SR 内的流动受多个蛋白调控：兰尼碱受体Ⅱ型（ryanodine recep⁃tor type2，RyR2）从SR 中释放大量Ca2+至胞浆（cyto⁃plasm，Cyto）引起心肌收缩；Ca2+-ATP 酶（Ca2+-ATPase type2，SERCA2）则通过主动转运重新回收Ca2+至SR 引起心肌舒张；此外，受磷蛋白（phospholamban，PLB）是SERCA2a蛋白的活性调节因子，参与调控心肌舒张过程[8]。研究表明，DM 可致SR 中Ca2+调控蛋白SERCA2 的表达量下调，而此改变正是引发DCM 的重要原因之一[9]。前人研究证实，规律运动可降低血糖、血脂，改善胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），并减少DM并发症的发生[10]。有研究表明运动能改善DM所致心脏功能损伤[11]，预防DCM的发生发展，但具体机制尚未阐明。例如，有氧运动可有效减轻DM大鼠心脏纤维化程度和功能障碍[12]，并改善DM 所致SR 调控蛋白SERCA2a和PLB基因表达变化[8]。基于此，本研究探讨不同运动方式能否通过调节SR 中Ca2+调控蛋白SER⁃CA2a 和PLB 表达，影响心肌SR 和胞浆钙代谢，进而改善DM大鼠心脏舒张功能，以期为运动疗法在防治DM相关心肌病变中的应用提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

6 周龄SPF 级雄性SD 大鼠44 只，平均体重170 ±10 g，购于成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证SCXK（川）2015-030，实验动物使用许可证SYXK（川）2014-189。所有大鼠均在动物标准实验环境中饲养，12︰12 小时明暗循环，自由摄食饮水，经1周适应性喂养后进行实验。

1.2 动物造模与干预方式

1.2.1 DM大鼠模型的建立及分组

除空白对照组（C 组，n=8）大鼠正常饮食外，其余36 只大鼠喂食高糖高脂饲料（67.0%常规饲料、10.0%猪油、20.0%蔗糖、1.0%胆酸钠、2.0%胆固醇）7 周后施以一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，30mg/kg），72 h 后非禁食血糖≥16.7 mmol/L 者判定为DM大鼠[13]。C组大鼠腹腔注射相同剂量的枸橼酸缓冲液。

随后，将26只成模大鼠随机分为DM模型组（D组，n=8），DM 有氧运动组（DA 组，n=9）和DM 抗阻运动组（DR组，n=9），并继续饲喂高糖高脂饲料。观察所有大鼠饮水量、饮食量、尿量、精神状况、皮毛润泽度和活动变化并记录体重（body weight，BW）。

1.2.2 运动方案

有氧运动：参照Bedford跑台运动模型[14]，大鼠适应性训练3 天后进入正式运动方案：跑台坡度0°，跑速20 m/min，每日训练60 min，每周训练5天，共计8周。

抗阻运动：参照Hornberger 的报道[15]，采用大鼠负重爬梯抗阻运动模型。爬梯坡度与地面85°夹角，爬梯长1 m。每级上下阶梯间隔2 cm。适应性负重爬梯3天（负重从10%BW 渐增至35%）后测试其最大负重（1RM），大鼠最初尾部负重75%BW 爬梯，后每次爬梯递增30 g 负重，直至不能完成一次完整爬梯。每周重新测试1RM。正式抗阻运动时，负荷分别为50%、75%、90% 1RM各3次，直至以100%1RM负重时，如不能完成3次者以实际运动能力为限（≤3次）负荷运动不能完成一次完整爬梯为止，必要时人为驱赶防止大鼠在爬梯上休息。每负重爬梯至顶部一次休息2 min，每周训练5天，共计8周。

1.3 组织取材与指标检测

1.3.1 血糖测定

末次运动结束后各组大鼠禁食12 h，抽取其尾部静脉血，采用强生血糖仪测定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。

1.3.2 超声心动图检查

于末次训练结束72 h 后，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mg/kg）麻醉，取仰卧位，大鼠心前区剃毛，使用Vivid 7dimension M 型超声心动检测仪对其进行胸壁超声心动图检测，探头频率为11.5 MHz。经胸骨旁左室长轴切面，M型超声测试记录心率（heart rate，HR）、左室收缩末内径（left ventricular inner diameter of systolic，LVIDs）、左室舒张末内径（left ventricular in⁃ner diameter of diastolic，LVIDd）、左室收缩末期容积（ESV）、左室舒张末期容积（end diastolic volume，EDV）、左室射血分数（ejection fraction，EF）和左室缩短分数（fractional shortening，FS）。所有数值通过3 个连续心动周期的平均值获取。

1.3.3 左心室血流动力学检测

采用左心室插管术和PowerLab数据采集分析系统检测大鼠左心室血流动力学的变化，记录大鼠心率（heart rate，HR）、左心室收缩压（left ventricular systol⁃ic pressure，LVSP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dt⁃max）、左心室舒张压（left ventricular diastolic pres⁃sure，LVDP）、左心室舒张末期压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室最大下降速率（－dp/dtmax）以及左心室松弛时间常数（Tau）。

1.3.4 组织取材

运动第8 周时测量大鼠体重，第8 周运动结束后72 h 进行取材，大鼠麻醉后消毒皮肤，打开腹腔，腹主动脉取血，用于血脂检测；随后取心脏，测量心脏湿重（heart weight，HW），用于计算BW/HW。4℃PBS 清洗后分离左心室，分别于组织固定液及液氮中保存用于后续相关检测。

1.3.5 血脂指标检测

采用生化分析仪检测血脂：包括甘油三酯（triglyc⁃erides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cho⁃lesterol，LDL-C）和极低密度脂蛋白胆固醇（very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-C）。

1.3.6 透射电镜检测心肌超微结构

取左心室心肌组织，在冰上切成1×1×1 mm3小块，加入1:10体积的3%戊二醛固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Eponate812环氧树脂包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，日立H-600Ⅳ型透射电镜视野（×6000，×15000）下观察各组大鼠心肌组织的肌纤维排列、核膜、线粒体等超微结构。

1.3.7 ELISA 测定空腹血清胰岛素（fasting insulin of serum，FINS）水平以及肌浆网、胞浆Ca2+浓度

FINS水平采用Mercodia公司的ELISA试剂盒（10-1250-01，Mercodia INC，Sweden）进行检测，操作严格按照试剂盒说明书进行。胰岛素抵抗指数（Homeosta⁃sis model assessment-insulin resistance index，HOMAIRI）=FBG（mmol/L）×FINS（mU/mL）/22.5。另外，心肌组织冰冻切片，采用GENMED 公司（GENMED SCIEN⁃TIFICS INC.U.S.A）组织肌浆网内Ca2+浓度荧光检测试剂盒（GMS10267.2）和胞浆内Ca2+浓度荧光（Fura-2）检测试剂盒（GMS10152.1）分别检测各组大鼠心肌肌浆网和胞浆Ca2+浓度，计算肌浆网Ca2+浓度与胞浆Ca2+浓度的比值（肌浆网/胞浆Ca2+荧光量）。

1.3.8 Western blot测定SERCA2a和PLB蛋白表达

液氮保存的心肌组织液100 mg︰1 ml 比例加入裂解液，裂解液使用前加入蛋白酶抑制剂Cocktail，在冰上剪碎、匀浆，于4℃翻滚裂解30 min，4℃1.2×104rpm离心5 min，取上清，加入4×Loading buffer，煮沸变性，12%SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜至PVDF 膜，于5%脱脂奶粉的TBST溶液4℃封闭过夜，用TBST溶液稀释的SERCA2 一抗（Santa CRUZ，sc-376235）、PLB 一抗（Abcam，ab219626）、Tubulin（β- Tubulin，碧云天AF1216）室温孵育2 h，TBST 洗5 min×3 次，1:5000 稀释的相应二抗孵育2 h，TBST洗5 min×3次，显影剂显影、定影、曝光。使用Gel-pro 软件分析蛋白条带灰度值，蛋白表达量用“目的蛋白/内参”计算，即心肌目的蛋白（SERCA2a、PLB）/内参Tubulin。

1.4 统计学处理

实验结果均用均数± 标准差（±s）表示，使用SPSS 19.0 统计软件包对数据进行统计处理。进行方差分析前先进行方差齐性检验，若方差齐性，采用LSD法进行事后检验；若方差不具齐性，则将原始数据转换至齐性后再作统计。对于不能转换至齐性的数据用Tamhane’s T2法进行统计。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验期间，C组大鼠饮食量、饮水量正常，反应灵敏活泼，精神状态良好。与C组相比，D组大鼠饮食量、饮水量、尿量增加，明显消瘦，皮毛无光泽，反应迟钝。与D 组相比，DA 组和DR 组大鼠皮毛情况、精神状态、反应速度有所改善。

2.2 BW、FBG、FINS和HOMA-IRI的变化

各组大鼠BW、FBG、FINS 和HOMA-IRI 的总体变化见表1。运动8 周后与C 组相比，D 组、DA 组、DR 组大鼠BW 明显下降（P<0.01）；与D 组相比，DA 组和DR组BW 均显著降低（P<0.01 或P<0.05），DA 组与DR 组之间差异不具有显著性（P>0.05）。

表1 各组大鼠BW、FBG、FINS和HOMA-IRI（n=8）

与C组相比，D组、DA组、DR组大鼠FBG明显升高（P<0.01或P<0.05）；与D组相比，DA组和DR组FBG均显著降低（P<0.01），且DR 组较DA 组降低更明显（P<0.05）。

与C组相比，D组和DA组大鼠FINS水平显著降低（P<0.01 或P<0.05），DR 组差异无统计学意义（P>0.05）；与D 组相比，DA 组和DR 组FINS 水平均明显升高（P<0.05 或P<0.01）；DA 组与DR 组之间差异不具有显著性（P>0.05）。

与C组相比，D组、DA组、DR组HOMA-IRI水平均显著升高（P<0.01或P<0.05）；与D组相比，DA组和DR组HOMA-IRI 均明显降低（P<0.01）；DA 组与DR 组之间差异不具有显著性（P>0.05）。

2.3 TG、TC、HDL-C、LDL-C和VLDL-C的变化

如表2所示，与C 组相比，D 组大鼠血清TG、TC、LDL-C 和VLDL-C 水平均明显升高（P<0.05），DA 组各指标均无显著变化（P>0.05），DR 组TG、TC、LDL-C 明显升高（P<0.05或P<0.01）；与D组相比，DA组和DR组大鼠TG、TC、LDL-C、VLDL-C 水平均显著降低（P<0.05）；DA组大鼠TG、TC和LDL-C水平明显低于DR组（P<0.05）。

表2 各组大鼠血脂代谢情况（n=8）

2.4 心脏湿重/体重的变化

与C 组相比，D 组、DA 组、DR 组大鼠心脏湿重/体重比值（HW/BW 值）均明显升高（P<0.05）；与D 组相比，DA 组和DR 组心脏湿重/体重值有所下降，差异不具有显著性（P>0.05）（图1）。

图1 各组大鼠心脏/体重比值（n=8）

2.5 心肌微细结构的变化

如图2所示，透射电镜下C组大鼠心肌肌原纤维相互连接，排列整齐致密，M线和Z线均清晰可见，线粒体丰富且结构清晰，大小正常、包膜及嵴完整；胞核内染色质均匀，核膜完整。D 组心肌细胞纤维排列紊乱，M线和Z线断裂，线粒体明显肿胀变性。DA组肌纤维排列仍较整齐，肌膜较完整；胞核内染色质轻度聚集，线粒体轻度肿胀。DR组心肌细胞纤维排列紊乱，M线和Z线断裂，线粒体肿胀明显；但胞核内染色质均匀，核膜完整。

图2 透射电镜下各组大鼠心肌超微结构变化（×6000，×15000；n=3）

2.6 超声心动图的变化

如图3所示，与C组相比，D组大鼠心腔明显减小，回声欠均匀，且心肌相对紊乱，收缩幅度也略有减弱。与D 组相比，DA 组大鼠心腔相比有所增大，心肌收缩力明显改善，心肌回声变的相对均匀，但仍未恢复到C组水平；DR 组大鼠心腔与D 组类似，且心肌回声紊乱更加明显且模糊。

图3 各组大鼠心肌左心室超声心动图情况（n=8）

如表3所示，C 组、D 组、DA 组、DR 组大鼠LVIDs、ESV、EF、FS等心脏收缩功能指标组间比较均无明显差异。与C 组相比，D 组大鼠LVIDd、EDV 显著降低（P<0.01）。与D 组相比，DA 组LVIDd 明显升高（P<0.05），DA 组EDV 以及DR 组LVIDd、EDV 均无显著差异（P>0.05）。与DA 组相比，DR 组LVIDd、EDV 明显降低（P<0.05）。

表3 各组大鼠超声心动图指标比较（n=8）

2.7 血流动力学的变化

如表4所示，与C 组相比，D 组HR 显著降低（P<0.01）；DA组和DR组较D组HR明显上升（P<0.05或P<0.01）且与C组比较差异不具有显著性（P>0.05）。

表4 各组大鼠血流动力学指标变化（n=8）

各组大鼠LVSP、+dp/dtmax 均无明显差异（P>0.05）。

与C 组相比，D 组、DA、DR 组LVDP 明显上升（P<0.01）；与D组相比，DA组LVDP显著下降（P<0.05），DR组无明显变化（P>0.05）；DA组较DR组LVDP明显升高（P<0.05）。

与C 组相比，D 组和DR 组LVEDP 显著升高（P<0.01），DA 组无明显变化（P>0.05）；与D 组相比，DA 组LVEDP 显著降低（P<0.05），DR 组差异不具有显著性（P>0.05）；DR组较DA组明显升高（P<0.01）。

与C 组相比，D 组和DR 组－dp/dtmax、Tau 显著降低（P<0.01），DA组无明显变化（P>0.05）；与D组相比，DA组显著上升（P<0.05），DR组无明显变化（P>0.05）。

2.8 心肌肌浆网与胞浆中Ca2+荧光量的变化

如表5、图4所示，与C 组相比，D 组肌浆网/胞浆Ca2+荧光量明显降低（P<0.01），DA组和DR组差异不显著（P>0.05）；与D组相比，DA组和DR组肌浆网/胞浆Ca2+荧光量均明显升高（P<0.05），但仍低于C组；DA组肌浆网/胞浆Ca2+荧光量略高于DR 组，差异不具有显著性（P>0.05）。

图4 各组大鼠心肌肌浆网和胞浆Ca2+荧光检测情况（n=8）

表5 各组大鼠心肌肌浆网/胞浆Ca2+荧光量变化（n=8）

2.9 心肌SERCA2a和PLB蛋白表达的变化

如图5所示，与C 组相比，D 组大鼠心肌SERCA2a和PLB 蛋白表达均明显降低（P<0.05）。与D 组相比，DA 组心肌SERCA2a 蛋白表达明显升高（P<0.05），PLB蛋白表达略有上升，差异不具有显著性（P>0.05）；而DR组心肌SERCA2a和PLB蛋白表达呈现升高趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。

图5 各组大鼠SERCA2a和PLB蛋白表达变化（n=8）

3 讨论

本研究采用7周高糖高脂饲料喂养联合一次小剂量STZ 注射制备DM 模型，结果显示DM 大鼠呈现异常高血糖、高血脂及典型“三多一少”症状，体重明显减轻，毛色无光泽，表明本研究成功建立DM大鼠模型，与有关研究结果一致[13，16]。随后，我们观察了从DM 发病到出现心功能障碍的完整过程，在持续高血糖8周后，心脏超声结果显示DM大鼠心脏－dp/dtmax明显下降、Tau 显著延长，同时HW/BW 比值明显升高，透射电镜下心肌肌原纤维呈现明显断裂、排列紊乱及线粒体肿胀变性的现象，从而说明心脏结构和功能明显受损。研究表明，DM导致的心肌舒张功能障碍早期以心肌松弛和弹性恢复力减弱主要特征，体现为心脏的顺应性下降；舒张晚期主要是心室被动充盈，体现为心脏的僵硬度[12]。本研究在大鼠成模后立即进行运动干预，结果表明，8周有氧和抗阻运动虽不能将血糖和血脂降至正常水平，但能有效控制BW 下降和FBG、TG、TC、LDL-C和VLDL-C升高，并可上调FINS水平，从而改善IR。同时DR组FBG水平明显低于DA组，而DA组TG、TC和LDL-C水平明显低于DR组（P<0.05），提示8周抗阻运动降血糖作用优于有氧运动，但有氧运动在改善脂代谢紊乱方面优于抗阻运动。这可能是由于抗阻运动能提高骨骼肌质量，骨骼肌可不依赖于胰岛素作用而独立调节糖代谢促进血糖的利用，达到降低血糖的效果。而脂代谢中因脂肪酶活化需要较长时间，长时间的有氧运动能够促进脂肪代谢。

此外，8周运动后DA组心脏－dp/dtmax明显升高、Tau 显著缩短并已趋于正常，心肌肌纤维排列较整齐，线粒体肿胀程度明显减轻，而DR组心脏－dp/dtmax和Tau 均无显著变化，且心肌细胞纤维排列紊乱，线粒体肿胀明显。以上结果提示8 周有氧运动能减轻DM 大鼠心脏结构损伤，延缓DM 早期心肌顺应性下降，以维持正常的心脏舒张功能，与郑松波等[17]报道的长期运动训练可以预防或逆转DCM的结果相似；然而，8周抗阻运动对DM 大鼠心脏结构和功能受损不具有改善作用。结合Ko等[18]指出12周抗阻运动能显著改善DM大鼠心肌线粒体数量、嵴断裂或模糊，笔者推测抗阻运动不同于有氧运动，其可能主要使心脏后负荷增加，且8周抗阻运动时长或许尚不足以产生明显效益。心肌细胞内Ca2+在调控蛋白的作用下规律性地释放和回收是心脏完成正常收缩和舒张的关键，其中调控蛋白SER⁃CA2a 的主要功能是在舒张期将胞质中的Ca2+回收至SR内，以维持心肌细胞内低浓度Ca2+[19]；PLB是心肌肌浆网上cAMP依赖性蛋白激酶的主要底物，磷酸化后可促进Ca2+转运，是SERCA2a的主要调节因子[20]。心肌细胞舒张期胞质中70%的Ca2+是通过SERCA2a被转运至SR[21]。Kin Man Chol[22]观察到，DM大鼠12周时因长期的高血糖环境使SERCA2a 蛋白表达下调，引起SR 中Ca2+回收障碍，导致心肌细胞的舒张功能下降。心力衰竭时钙泵功能受损，降低SR 内Ca2+摄取，SERCA2a、PLB 的mRNA 和蛋白表达下调[23，24]。已有研究表明长期耐力运动能提高SR摄取Ca2+的能力[8]，然而抗阻运动对于DM 大鼠心肌Ca2+回收及相关调控蛋白的影响尚未见报道。本研究中，DM 大鼠8 周时心肌肌浆网/胞浆Ca2+浓度以及SERCA2a 和PLB 蛋白表达均明显低于C 组（P<0.05 或P<0.01），与之前Kin[21]研究结果一致，提示DM 大鼠8 周时即可引起SR 内Ca2+回收障碍，最终大量Ca2+潴留在Cyto 内。本实验在8 周运动干预后，DA组和DR组大鼠心肌肌浆网/胞浆Ca2+浓度明显升高，SERCA2a和PLB蛋白表达亦呈现上升趋势，其中DA组大鼠心肌SERCA2a蛋白表达明显升高（P<0.05），而两组心肌PLB 蛋白表达较D 组无明显差异（P>0.05），提示8周运动干预可能是通过上调Ca2+调控蛋白SERCA2a 表达而改善DM 大鼠心脏左室舒张功能，且有氧运动的干预效果优于抗阻运动。Ca2+紊乱和心肌超微结构损伤是舒张功能降低的重要因素，有氧运动一方面能上调SERCA2a 和PLB 蛋白表达，进而调节Ca2+代谢；另一方面因有氧运动的后负荷较小，能改善心肌的顺应性以及心肌的超微结构，最终提高糖尿病大鼠心肌舒张功能。此外，抗阻运动能增加心肌间质胶原纤维含量使心肌顺应性降低，而未能改善心肌超微结构损伤甚至有加重趋势，尽管上调SERCA2a 和PLB蛋白表达，但不足以改变心肌舒张功能。