跑台运动对帕金森病模型小鼠黑质、海马CA1区ERK1/2信号通路及记忆能力的影响

2021-09-24张康付燕张业廷宋文静

中国运动医学杂志 2021年6期

张康付燕张业廷宋文静

1 四川师范大学体育教育研究中心（成都610101）

2 北京体育大学（北京100084）

3 西南民族大学体育学院（成都610225） 4 成都大学体育学院（成都610106）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是继阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s dementia，AD）之后最常见的神经退行性疾病。其主要病理特征为黑质纹状体多巴胺能神经元进行性死亡，导致多巴胺耗竭和运动障碍[1]。除运动障碍外，认知、嗅觉、抑郁以及视幻觉等非运动症状在PD 发病过程中也较常见。这些非运动症状往往在未表现出明显运动障碍之前已经出现，如：认知功能下降，尤其是海马依赖性记忆能力下降[2]。

多巴胺能神经元主要分布于中脑黑质、腹侧被盖区、下丘脑以及各脑室周围。其中，黑质多巴胺能神经元可以通过中脑边缘系统途径投射到海马区，表明黑质多巴胺分泌不足可能会影响海马依赖性记忆能力[3]。基于影像学的研究发现，利用海马皮质厚度和海马体积鉴别帕金森痴呆（Parkinson disease with demen⁃tia，PDD）的准确率高达80%[4]。因此，黑质及其神经纤维支配的海马区可能是PD 认知功能下降的基础。目前，为了更深入研究PD，研究者通过1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl- 1，2，3，6-tet⁃rahydropyridine，MPTP）染毒的方式成功模拟了PD 的发病特征，现已被广泛应用于PD啮齿类动物模型的建立中[5]。许多研究者也证实了MPTP可以通过损伤黑质多巴胺能神经元引起PD 症状，并且在MPTP 模型中通常可以观察到与PD 相似的海马依赖性记忆等认知功能明显受损[6]。

细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulat⁃ed kinase，ERK）是多巴胺及谷氨酸N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-Metllyl-D-Aspanate receptor，NMDAR）通路中共同的下游靶点，也是海马依赖性记忆能力中不可或缺的信号分子之一[7，8]。体内的脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）与受体酪氨酸激酶B（Tropomyosin receptor kinase B，TrkB）结合可以激活ERK1/2 及其下游的环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP- response element binding protein，CREB），保护神经元存活、神经递质释放以及突触可塑性，调节海马依赖性记忆能力[9]。此外，多巴胺（dopa⁃mine，DA）与多巴胺D2 受体（dopamine 2 receptor，D2R）结合，可以直接上调ERK1/2蛋白表达，促进细胞增殖[8]。目前，临床研究中已经发现PD 患者黑质中存在较密集的磷酸化ERK1/2[10]。改善黑质和海马区ERK1/2 信号通路中磷酸化蛋白和总蛋白表达都可能是预防和延缓PD记忆能力下降的重要途径。

PD记忆能力下降往往在治疗过程中被低估，虽然记忆能力下降是PD迫切需要讨论和解决的重要问题，但迄今为止，很少有研究从整体上解决PD患者的记忆问题。运动可以改善多种神经退行性疾病引起的神经元受损，在神经发生、神经元存活以及神经可塑性中发挥着显著效用。已有研究者尝试从不同角度解释体育锻炼对多巴胺耗竭引起的海马神经发生以及海马依赖性记忆能力产生积极效应的原因，但黑质和海马CA1区ERK1/2信号通路在运动改善PD记忆能力中的作用尚未被研究。本研究主要通过观察运动干预后小鼠记忆能力、突触可塑性蛋白和黑质、海马CA1 区ERK1/2信号通路变化，探讨运动预防和改善PD记忆能力的可能生物学机制；同时，通过阻断ERK1/2 分子观察黑质和海马CA1区ERK1/2信号通路在运动改善PD记忆能力中的作用。

1 对象与方法

1.1 实验对象及分组

36 只正常健康雌性C57BL/6 小鼠，体重19.02 ±0.98 g，于SPF级动物实验室分6笼饲养，每笼6只。自然喂养7天后，随机分为6组：生理盐水对照组（SC组）、PD 模型组（PD 组）、生理盐水+运动组（SE 组）、PD＋运动组（PDE组）、PD＋运动＋二甲基亚砜（dimethyl sulf⁃oxide，DMSO）组（PDED 组）和PD＋运动＋PD98059 组（PDEP 组），每组6只。整个实验过程保持饲养环境干净整洁，通气良好，饲养温度保持在23℃± 2℃，湿度保持在40%～60%，每日保持12小时光照/黑暗循环。

1.2 实验方案及模型评价

实验流程见图1。

图1 实验流程

1.2.1 PD模型构建

PD、PDE、PDED和PDEP组小鼠按照30 mg/kg[11]的剂量每隔3.5 天腹腔注射MPTP 溶液1 次，2 次/周，共5周。SC 和SE 组在相同的时间段腹腔注射30 mg/kg 剂量的生理盐水，2次/周，共5周。

1.2.2 跑台运动方案

SE、PDE、PDED 和PDEP 组小鼠进行跑台运动干预，跑台运动于MPTP 注射第一天开始，每天19:00～20:00 固定时间进行。自然喂养结束后，第1 周为适应跑台阶段，采用较低运动强度进行。其中，第1～2 天跑速为6 m/min，第3～4 天跑速为8 m/min，第5 天为10 m/min，每天运动时间均为60 min。第2 周循序渐进增加跑台速度，最终跑速设定为12 m/min[12]，运动60 min/天，共5天/周，持续6周。八臂迷宫实验期间小鼠持续运动1 周；整个干预过程中跑台坡度始终设置为0°。

1.2.3 ERK1/2信号阻断

PDEP 组按照10 ml/kg 体重腹腔注射PD98059 溶液阻断ERK1/2信号分子[13，14]，PDED组腹腔注射同等剂量10% DMSO 溶液作为对照。PD98059和DMSO 的注射时间选择每次运动干预前2小时进行。

1.2.4 PD模型评价

PD 模型评价标准：运动干预结束后，通过震颤麻痹评分量表将小鼠的震颤麻痹分为0～4等级，0级：无任何症状；1级：出现弓背、竖毛、间歇性小震颤，但活动自如；2级：吞咽频繁，频繁性震颤，后肢张开，活动逐渐受限；3 级：出现流涎、持续性震颤，四肢僵硬，活动受限；4 级，因全身麻痹而死亡[15]。通过黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）染色判断PD 模型小鼠黑质多巴胺能神经元的功能受损情况。

1.3 测试方法、指标

1.3.1 八臂迷宫测试小鼠记忆能力

八臂迷宫是用来评价药物或大脑受损状态下学习和记忆表现的一种有效方式。八臂迷宫实验包括训练和测试两个阶段。训练阶段：禁食12 小时，保持体重在80%～85%之间。迷宫中央区和各臂均放置3～4粒直径约为2 mm 的圆形食物，将3～4 只小鼠放入中央区30 s后，打开各臂通道自由活动10 min，2次/天。之后，将每只小鼠单独放入迷宫，在1、3、5、7号臂食盒的近端放一粒食物，小鼠吃尽食物或停留10 min 取出小鼠，2次/天。

测试阶段：1、3、5、7 号臂中放入一粒直径约为2 mm的圆形食物，将小鼠放入中央区30 s后自由活动并寻找食物10 min，当吃尽各臂食物或10 min之内未吃完食物，系统均自动终止实验。计算机自动输出检测指标：①工作记忆错误：同一次训练中小鼠重复进入已经吃过食物的臂；②工作记忆错误率：工作记忆错误与总的入臂次数之比；③参考记忆错误：小鼠进入不曾放过食物的臂；④参考记忆错误率：参考记忆错误与总的入臂次数之比。

1.3.2 取材

行为学测试结束后，断颈处死。取小鼠完整脑组织，放入液氮速冻，－80℃冰箱保存，待制作黑质、海马部位的切片。根据脑立体定位图谱，黑质切片选取前囟－4.8 mm 到－6.3 mm，海马CA1 区选取约前囟－2.12 mm，切片约10 mm。

1.3.3 TH免疫组化染色

利用免疫组化染色观察小鼠脑组织切片中黑质TH阳性细胞的变化。脑组织切片脱蜡后放入染色缸，3%甲醛双氧水室温10 min；0.1%磷酸缓冲盐（PBS）清洗切片3 次，5 min/次。洗净的切片放入0.01 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），加热直至沸腾5 min，重复1次。PBS清洗3×5 min/次，滴加10%山羊血清封闭液封20 min，滴加TH一抗（浓度1︰800），4℃孵育过夜。滴加生物素化山羊抗兔二抗，37℃孵化30 min；0.1%PBS清洗3×5 min/次；DAB显色、复染；中性树胶封片，自然晾干。将载玻片放入蔡司光学显微镜上进行扫描成像，并使用MBF生物科学数字显微镜摄像机（Willis⁃ton，VT）在计算机上进行成像；在100倍放大倍数下，通过人工计数每张拍照图像来统计TH细胞的数量。

1.3.4 免疫荧光染色

利用免疫荧光观察小鼠脑组织切片中黑质和海马CA1 区中ERK1/2、CREB、突触素（synaptophysin，SYN）和突触后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD-95）PSD-95 蛋白表达。脱蜡至水；0.01 M 柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）中加热至沸腾，重复1 次；PBS 清洗5 min/次，反复清洗3次。37℃室温下使用10%山羊血清封闭30 min；滴加一定比例ERK1/2、CREB、SYN 和PSD-95 一抗（浓度：1︰50、1︰50、1︰400 和1︰100），4℃过夜。PBS 清洗3×5 min/次；滴加二抗，37℃孵育30 min。PBS 清洗切片3×5 min/次；滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-Diamidino-2-Phenylindole，Di⁃hydrochloride，DAPI）染液，37℃孵育30 min；PBS 清洗切片3×5 min/次；用抗荧光衰减封片剂封片。采用免疫荧光显微镜观察并采集黑质及海马区的图像并分析结果；使用image J 软件测量平均荧光强度值，对黑质和海马神经元蛋白表达进行半定量分析。特定区域荧光强度公式为：平均荧光强度=该区域荧光强度总和/该区域面积。

1.4 主要实验试剂与仪器

MPTP（proteintech 公司），Anti-Tyrosine Hydroxy⁃lase 抗体（abcam 公司），ERK1/2 Antibody（proteintech公司），Anti-SYN Antibody（abcam公司），PSD-95 Anti⁃body（proteintech 公司），CERB Antibody（proteintech 公司），β-actin 兔克隆抗体（abcam 公司），冰冻切片机（Leica 公司），盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司），载玻片（江苏世泰实验器材有限公司），荧光显微镜（德国Leica公司）等。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0对各组小鼠行为学和分子生物学数据进行分析，结果均采用均值±标准差（±s）表示，组间采用多因素方差分析（ANOVA）法分析不同指标的差异性，采用最小显著性差异（LSD）法对各指标进行多重比较检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后PD小鼠黑质多巴胺能神经元及行为学比较

通过震颤麻痹评分表对PD组小鼠进行评级发现，PD 小鼠成模率约83.33%。具体表现为，约66.67%的小鼠表现出第二等级的典型特征：竖毛、竖尾、流涎、持续震颤、四肢僵硬；16.67%的小鼠表现出第一等级特征：竖毛、间歇性小震颤和弓背。从黑质TH 染色结果中发现，与SC组相比，PD组黑质TH阳性细胞数量平均减少约45.75%（8.23 ± 1.21 vs.17.99 ± 0.95，P<0.01），SE组和PDE组小鼠黑质TH阳性细胞数量比SC组和PD 组小鼠明显增加（26.31 ± 2.14 vs.17.99 ±0.95，13.85 ± 1.27 vs.8.23 ± 1.21，P<0.05）。见图2。

图2 SC、PD、SE和PDE组小鼠黑质TH染色（标尺：100μm）

2.2 八臂迷宫测试中各组小鼠记忆能力比较

由表1 可知，与SC 组相比，PD 组小鼠工作记忆错误次数和工作记忆错误率显著升高（P<0.05）；SE 组小鼠工作记忆错误次数和工作记忆错误率与SC 组相比仅表现出下降的趋势。与PD组小鼠相比，PDE组小鼠工作记忆错误次数和工作记忆错误率均显著降低（P<0.01）；与PDE组相比，PDED组小鼠工作记忆错误次数和工作记忆错误率均未表现出显著差异。PDEP 组小鼠与PDED 组小鼠之间工作记忆错误次数和工作记忆错误率也未显示显著差异，但从数据来看，PDEP 小鼠工作记忆错误率平均增加幅度更大。

表1 八臂迷宫测试中各组小鼠记忆能力比较（n=6）

PD 组小鼠参考记忆错误次数显著高于SC 组（P<0.05）；参考记忆错误率未表现出显著变化。PDE 组小鼠参考记忆错误次数和参考记忆错误率比PD 组均显著降低（P<0.05）；与SC 组相比，SE 组小鼠参考记忆错误次数和参考记忆错误率均表现出下降的趋势，但不显著。PDED 组小鼠参考记忆错误率明显高于PDE 组（P<0.05），PDED组与PDEP组之间未表现出显著差异；但从数据来看，PDEP组小鼠参考记忆错误率和参考记忆错误次数均存在增加的趋势。

2.3 各组小鼠黑质、海马CA1 区SYN 和PSD-95 蛋白表达比较

如图3、图4、表2所示，与SC 组相比，PD 组小鼠黑质SYN和PSD-95染色面积明显减少，但蛋白表达仅表现出了下降的趋势。与PD 组相比，PDE 组小鼠黑质SYN和PSD-95染色面积增加，但蛋白表达未表现出显著变化，仅表现出升高的趋势。与PDE 组相比，PDED组小鼠黑质SYN 和PSD-95 染色面积及蛋白表达均无显著差异。与PDED组相比，PDEP组小鼠黑质PSD-95蛋白表达显著下降（P<0.01）。

表2 各组小鼠黑质、海马CA1区SYN和PSD-95蛋白表达比较（n=6）

图3 各组小鼠黑质、海马CA1区SYN蛋白表达比较（绿色为SYN染色，蓝色为DAPI染色）

图4 各组小鼠黑质、海马CA1区PSD-95蛋白表达比较（绿色为PSD-95染色，蓝色为DAPI染色）

与SC 组比，PD 组小鼠海马CA1 区SYN 和PSD-95染色面积明显减少，但蛋白表达仅表现出了下降的趋势；SE 组小鼠海马CA1 区SYN 和PSD-95 染色面积明显增加，蛋白表达显著升高（P<0.01）。与PD 组相比，PDE 组小鼠SYN 染色面积明显增加，蛋白表达显著升高（P<0.01），PSD-95未表现出显著变化。与PDE组相比，PDED小鼠海马CA1区SYN蛋白表达显著降低（P<0.01）。与PDED组相比，PDEP组SYN蛋白表达显著降低（P<0.01），PSD-95未显示出显著差异。

2.4 各组小鼠黑质、海马CA1 区ERK1/2、CREB 蛋白表达比较

如图5、图6、表3所示，与SC 组相比，PD 组小鼠黑质ERK1/2 和CREB 免疫荧光染色面积均明显减少，蛋白表达均显著降低；SE组小鼠黑质ERK1/2免疫荧光染色面积明显增加，蛋白表达显著升高（P<0.01）。与PD组相比，PDE 组黑质ERK1/2 和CREB 免疫荧光染色面积均明显增加，蛋白表达显著升高（P<0.01）。与PDE组相比，PDED 组小鼠黑质ERK1/2 和CREB 免疫荧光染色面积和蛋白表达均未表现出显著变化。PDEP 组比PDED 组黑质ERK1/2 和CREB 蛋白表达显著降低（P<0.01和P<0.05）。

表3 各组小鼠黑质、海马CA1区ERK1/2信号通路中的相关蛋白表达比较（n=6）

图5 各组小鼠黑质、海马CA1区ERK1/2蛋白表达比较（绿色为ERK1/2染色，蓝色为DAPI染色）

图6 各组小鼠黑质、海马CA1区CREB蛋白表达比较（绿色为CREB染色，蓝色为DAPI染色）

与SC组相比，PD组小鼠海马CA1区CREB免疫荧光染色面积明显减少，蛋白表达显著减少（P<0.01），ERK1/2 仅表现出下降的趋势；SE 组小鼠海马CA1 区ERK1/2免疫荧光染色面积明显增加，蛋白表达显著升高（P<0.01）。与PD 组相比，PDE 组小鼠海马CA1 区ERK1/2免疫荧光染色面积明显增加，蛋白表达显著升高（P<0.01）；CREB 变化不显著，仅表现出升高的趋势。与PDED 组相比，PDEP 组小鼠CA1 区ERK1/2 和CREB免疫荧光染色面积明显减少，蛋白表达显著减少（P<0.01）；PDED组与PDE组之间无显著差异。

3 讨论

TH 是儿茶酚胺（catecholamine，CA）（多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素等）生物合成的起始和限速酶[16]，参与了PD等多种CA疾病的发病机制，对于依赖于CA细胞活性的神经元功能至关重要。通过TH染色观察黑质多巴胺能神经元的完整性是目前判断PD 病理进程的“金标准”[17]。目前，睾丸激素已被认为是导致PD 的潜在危险因素，因此本研究采用与Lu[17]、Gong[18]、Torres[19]等研究相同的雌性小鼠作为研究对象。本研究结果显示，正常小鼠黑质TH阳性细胞较多，MPTP处理的小鼠黑质TH 阳性细胞计数明显降低，说明MPTP染毒诱导小鼠产生了与PD 相似的多巴胺能神经元功能异常。以往研究指出，MPTP处理后小鼠黑质致密部TH 减少54.0% ± 4.3%[20]。Churchill 等[21]也发现MPTP处理的小鼠黑质致密部TH 计数下降50%，4 周后下降55%，均与本研究结果相近。本研究中经过跑台运动的PD 模型小鼠黑质TH 阳性细胞计数明显高于PD 模型组，说明跑台运动可以有效抑制多巴胺能神经元功能受损，延缓PD的发展速度。基于人体或动物实验的研究均发现，运动可以有效缓解PD导致的运动行为障碍和黑质TH活性降低或数量减少。Cugusi等[22]研究发现，跑步机运动可以显著改善PD 患者的步行距离、下肢肌肉力量、平衡能力、活动安全性、抑郁和冷漠等症状，揭示了跑步机运动在改善PD患者运动症状和非运动症状方面的有效性。Koo 等[23]究发现跑台运动能够促进PD 小鼠黑质TH 表达，抑制多巴胺能神经元的丢失。因此，运动在延缓或改善PD 病程中具有重要价值，可以作为PD治疗中的一种重要的辅助手段。

此外，本研究结果还显示PD组小鼠的工作记忆错误次数、工作记忆错误率和参考记忆错误次数明显高于生理盐水对照组，运动干预的PD组小鼠工作记忆错误次数、工作记忆错误率、参考记忆错误次数以及参考记忆错误率比PD 组小鼠明显降低，说明PD 小鼠表现出了明显的记忆能力减退，跑台运动可以有效改善PD小鼠和正常小鼠的记忆能力。这一结果与许多国外临床研究的结论相同。如：Bello等[24]研究证实，跑步机运动能够有效提高PD患者的认知任务成绩。Cruise等[25]发现有氧运动可以选择性改善PD 患者的认知功能，如：工作记忆和执行功能。现在越来越多的证据表明，记忆能力与突触可塑性有关，突触功能减退或突触相关蛋白表达下降是早期神经退行性疾病常见的病理特征[26]。SYN 和PSD-95 蛋白是神经元突触的一种特异性突触前标志蛋白和突触后致密蛋白，参与突触生长、发育以及重塑，在各种记忆中发挥着不可或缺的作用[17，27，28]。一些基于PD 动物模型的研究发现，PD 小鼠海马突触结构、功能可塑性受损和突触标志蛋白表达失调。Qu等[29]在MPTP 诱导的PD小鼠中发现海马DG区和CA3区苔藓纤维强度明显降低，突触可塑性受损，认为其机制可能涉及到MPTP 下调了SYN 和PSD-95 等的表达，以及降低BDNF-TrkB 通路的活性。本研究结果发现，PD 小鼠黑质和海马CA1 区SYN 和PSD-95 表达均表现出了降低的趋势，跑台运动明显增强了海马CA1区SYN蛋白表达，同时，黑质SYN、PSD-95蛋白表达存在上调的趋势，说明跑台运动具有增强PD小鼠黑质和海马CA1区突触可塑性的潜力，最终导致PD小鼠记忆能力得到改善。虽然运动干预的正常小鼠工作记忆和参考记忆错误次/率仅表现出了下降的趋势，但海马CA1 区SYN 和PSD-95 蛋白表达均显著升高。本研究考虑到PD 的运动障碍，选择较小运动强度干预，因此，可能较小强度运动引起的正常小鼠突触可塑性的改变程度未能达到记忆能力改善的阈值，新生成的神经元突触或者增强的突触功能达不到改善记忆能力的效果，后期将对不同运动强度的干预效果进行进一步研究。Klein[2]在研究中也发现运动可以改善MPTP 小鼠Morris 水迷宫测试的认知功能，但随着蛋白或基因表达的升高将出现天花板效应，升高到一定水平后，运动不再有助于认知行为的进一步改善，该研究与本研究结果相似。以往关于PD黑质、海马突触可塑性和认知功能机制的研究指出，PD记忆能力和突触可塑性的改变与BDNF 表达上调有关。Hirsch 等[30]系统回顾了2017年6月之前收录在MEDLINE、EMBASE、Cochrane Library、PsycINFO 和PubMed 等数据库中关于运动与PD 患者血清脑源性神经营养因子（brain-derived neu⁃rotrophic factor，BDNF）的研究，其中两项随机对照试验和四项预实验研究提供了运动疗法增加PD 患者血清BDNF的直接证据。基于MPTP小鼠的文献均证实，振动和跑台运动均能够上调PD 小鼠脑组织BDNF 表达，预防多巴胺能神经元功能受损，并提出运动时间越长对细胞水平的增益效果越明显[31，32]。因此，本研究认为BDNF及其下游因子的改变可能是运动改善PD记忆能力的重要原因。

ERK1/2 信号通路是BDNF 下游调控神经元存活、神经递质释放以及突触可塑性的重要途径，也是目前研究最多的信号通路之一。越来越多的证据表明，PD与ERK1/2 活性密切相关，甚至一些研究者将PD 归因于ERK 基因表达的依赖性变化[33]。静息状态下，ERK位于细胞质中，当ERK被激活时可以迅速磷酸化，进入细胞核调控其他转录因子的活性，影响SYN和PSD-95等特异性蛋白表达，引起细胞能量代谢、生理生化功能改变，进而发挥维持神经元发育和突触可塑性稳态的作用[34]。Liang等[35]观察MPTP诱导的亚急性PD模型小鼠发现，中脑p-ERK1/2/ERK1/2表达显著降低，治疗后随着PD 症状的改善，p-ERK1/2/ERK1/2 表达明显升高。但也有研究得出不同的结论，Siracusa 等[36]观察MPTP诱导的亚急性PD模型小鼠发现，PD模型小鼠多巴胺能神经元p-ERK1/2 蛋白表达明显增强，认为PD症状的改善与p-ERK1/2 蛋白表达下降有关。ERK1/2磷酸化水平的改变涉及p-ERK1/2 蛋白的改变和ERK1/2蛋白的改变。我们推测，PD脑组织中p-ERK1/2/ERK1/2 的改变不仅仅是p-ERK1/2 发生了改变，ERK1/2信号通路中相关因子的改变在改善PD症状中也发挥着关键作用。以往较少有研究从ERK1/2 通路入手探讨ERK1/2 信号通路中相关因子表达的改变是否是PD 认知症状改变的潜在原因。本研究针对ERK1/2表达进行检测、分析，研究结果显示，与生理盐水对照组相比，PD 模型小鼠黑质和海马CA1 区CREB蛋白表达和黑质ERK1/2蛋白表达均显著降低，跑台运动的PD模型小鼠黑质ERK1/2、CREB以及海马CA1区ERK1/2蛋白表达明显升高，说明运动有效地增强了PD模型小鼠黑质和海马CA1 区ERK1/2 信号通路中相关因子表达。最近的一项研究显示，ERK1/2-CREB信号通路参与促进海马神经元树突棘丝状伪足、蘑菇状突起及谷氨酸能兴奋性突触的形成[37]。阻断ERK1/2 信号可以减少新的树突棘和伪足的形成，抑制长时程增强（long-term potentiation，LTP）[38，39]。因此，PD 模型小鼠记忆能力和突触可塑性的改善可能是运动上调了黑质和海马CA1区ERK1/2信号通路中相关因子表达。

为了进一步证实ERK1/2 信号通路在跑台运动改善PD小鼠记忆能力中的作用，本研究采用PD98059抑制ERK1/2 分子观察PD 小鼠记忆能力以及黑质、海马CA1 区SYN 和PSD-95 蛋白变化，结果显示ERK1/2 分子阻断后，跑台运动干预的PD小鼠黑质和海马CA1区SYN或PSD-95蛋白表达显著降低，工作记忆和参考记忆错误率存在降低的趋势；注射10%DMSO溶液的小鼠与仅进行运动干预的PD 小鼠相比无显著差异，海马CA1区SYN蛋白下调，说明10%DMSO溶液对小鼠记忆能力结果的影响较小，ERK1/2信号通路在跑台运动改善PD 小鼠黑质和海马CA1 区突触可塑性和记忆能力中发挥着关键作用，进一步证实跑台运动可以通过上调ERK1/2信号通路中相关因子表达，改善黑质和海马CA1区突触可塑性，增强PD小鼠记忆能力。ERK1/2分子阻断后小鼠参考记忆和工作记忆仅表现出了增强的趋势。可能是由于PD是一种多系统的退行性疾病，除黑质和海马投射路径外，额叶ERK1/2蛋白表达异常等也是导致PD认知功能受损的关键原因。Luo等[40]也发现ERK激酶抑制剂PD98095定点注射前额叶内可以显著抑制ERK1/2 和CREB 标记细胞数量，并严重损害大鼠长期回避恐惧记忆的恢复。因此，推测PD小鼠记忆能力的下降与改善可能也与额叶功能有关，且记忆能力受损的不同阶段可能涉及到不同的神经机制，对此，尚需进一步研究证实。