从网络药理学分析三七-马齿苋药对配伍治疗溃疡性结肠炎的效用机制研究

陈思羽，唐 昂，张 涛，黄李冰雪，刘 畅

(广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)作为消化科的疑难病，其发病率最近10年呈上升趋势，尤其是在中国的发病率增高最为明显，因UC病因未明，临床尚缺乏难以根治的手段而降低患者的生活质量，增加医疗负担[1-3]。中医学虽无UC的病名，但是根据其症状将其归属于“休息痢”“久痢”范畴，其基本病机以脾胃虚弱为本、湿热瘀毒为标而贯穿疾病始终，治疗上当遵守“发时治标，平时治本”的基本原则，可以健脾清热活血为基本大法进行治疗，健脾清热活血方是基于全国名老中医劳绍贤教授验方溃结灵、谢建群教授验方清肠栓等基础上加减而成，该方具有健脾利湿、清热解毒、活血定痛的功效。无论临床研究或动物实验均证实健脾清热活血方可能通过诱导炎症缓解，修复肠道黏膜，促进肠上皮细胞修复，发挥防治 UC的效用[4-5]。其中三七和马齿苋是健脾清热活血方中的主要药物配对，具有清热利湿、化瘀止痛的功效；现代药理学研究也表明三七和马齿苋具有止血活血双向调节、抗炎、抗氧化的作用，并参与各种免疫调节[6]。由此，本研究采用网络药理学方法，从分子水平分析三七-马齿苋的有效化学成分，预测其作用靶点及相关信号通路，探究三七-马齿苋配伍治疗UC的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1UC相关靶点的筛选 在Gene Expression Omnibus(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中挖掘mRNA高通量RNA测序和微阵列图谱，收集UC患者的差异表达基因数据。mRNA表达数据采用log2算法进行归一化和变换，用Fold change(FC)法检测UC组和正常组mRNAs的差异表达。如果|logFC|>1且adj.PValue< 0.05，则将mRNA标记为差异表达基因。同时利用R语言绘制差异表达基因热图和火山图。

1.2三七-马齿苋有效化合物及对应靶点的筛选利用TCMSP平台(中药系统药理学分析平台，http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索三七、马齿苋的主要化学成分，以ADME性质[7]：口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18为依据筛选可能入血的有效成分，并进行整理；并通过DrugBank数据库筛选出化合物对应的靶点，进行整理并删除重复项。

1.3“化合物-交集靶点”网络及PPI网络的构建利用Perl语言获得UC差异表达基因与三七-马齿苋对应靶点基因的交集靶点。将三七-马齿苋有效化合物与其对应交集靶点数据导入Cytoscape 3.7.2软件(http://www.cytoscape.org/)构建“化合物-交集靶点”网络图并进行拓扑分析。同时将交集靶点导入STRING 11.0数据库(https://string-db.org)进行分析得到蛋白互作网络图，根据Degree值和Betweenness Centrality筛选核心作用靶点。

1.4基因本体论及KEGG通路分析 利用R软件包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”对交集靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能分析，包括生物过程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和细胞成分(Cellular Component,CC)分析；同时进行基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，得到三七-马齿苋作用于UC的主要通路，并通过R语言对富集分析结果进行可视化处理。

1.5交集靶点-KEGG关系网络图的构建 将得到三七-马齿苋作用于UC的主要通路与对应交集靶点文件导入Cytoscape 3.7.2软件构建“交集靶点-KEGG”关系网络图并进行分析。

2 结 果

2.1UC差异表达基因的确定 从GEO数据库下载符合要求的GSE38713数据集，并利用R软件包“limma”对其进行分析。GSE38713数据集包含13个正常样本和30个UC患者样本。根据FC分析(筛选条件|logFC|>1且adj.PValue< 0.05)得到568个差异表达基因，其中305个表达上调，263个表达下调，见图1；分别取前20个基因进行热图绘制，见图2。

图1 溃疡性结肠炎GSE38713差异表达基因火山图

图2 溃疡性结肠炎GSE38713差异表达基因FC分析热图

2.2三七-马齿苋的有效化合物收集及靶点预测在TCMSP平台以三七、马齿苋为关键词，共搜索到173个相关化合物。根据药代动力学和代谢(ADME)特性对化合物进行筛选，以OB≥30%及DL≥0.18为筛选条件，筛得三七化合物8个、马齿苋化合物10个共18个化合物，去重后共得到16个有效化合物，见表1。应用DrugBank数据库收集并筛选这16个有效化合物对应的靶点，整理全部靶点并删除重复项。

表1 三七-马齿苋16个有效化合物信息表

2.3“化合物-交集靶点”网络图的构建及拓扑分析 应用Perl语言分析获得UC差异表达基因与三七-马齿苋对应靶点基因的交集靶点共64个，与交集靶点相互作用的有效化合物14个。将这14个有效化合物与交集靶点数据导入Cytoscape 3.7.2软件构建“化合物-交集靶点”网络，见图3。该网络图由78个节点(14个化合物节点和64个靶点节点)和121条边组成，其中三角形代表靶点、椭圆形代表化合物，且红色椭圆形化合物节点表示三七与马齿苋共同化合物。图中三七-马齿苋多个化合物对应相同靶点、多个靶点同时也对应相同化合物，由此可见三七-马齿苋配伍多成分、多靶点的特点。接着，利用Cytoscape中的Network Analysis插件进一步进行拓扑学分析，根据网络节点的Degree和Betweenness Centrality大小筛选出该网络中的关键化合物(槲皮素、花生四烯酸、豆甾醇、山奈酚、木犀草素)及核心靶点(PTGS1、NCOA2、JUN、ALOX5、RXRA、IL1B、PPARG、MMP1、CHRM3)，认为这些化合物及靶点在整个网络中起到核心作用。

图3 三七-马齿苋有效化合物-交集靶点网络图

2.4三七-马齿苋配伍治疗UC作用靶点的PPI分析 将64个交集靶点导入STRING数据库，设置置信度大于0.150，得到图4A。接着设置置信度大于0.400，提取图4A网络中关联系数更紧密的网络，得到图4B。为了更深层次的提取图4A网络图中的核心网络，进一步设置置信度大于0.900，并剔除孤立的靶点蛋白，最终获得核心蛋白互作信息图4C。并导入Cytoscape软件进行网络拓扑学分析得到三七-马齿苋配伍治疗UC的核心靶点蛋白互作网络(见图4D)。图4D网络由42个节点和53边组成，经网络拓扑学分析可知，节点平均Degree为2.523 8，大于平均Degree的节点有21个；节点平均Betweenness Centrality为0.104 9，大于平均Betweenness Centrality的节点有21个。根据网络节点的Degree和Betweenness Centrality筛选出靠前的核心作用靶点，包括JUN、IL1B、RXRA、MMP9、IRF1、CTSD、STAT1、PPARG、NCOA2、CDK1等，认为这些核心作用靶点在网络中起到关键性作用。

图4 三七-马齿苋治疗溃疡性结肠炎交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用分析

2.5GO功能富集分析及KEGG通路分析 利用R软件包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”对交集靶点对交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。根据PValue.adjust<0.05分别确定了前20个GO条目，分别列出生物过程、分子功能、细胞成分对应的条目，见图5。其中，生物过程中在体液水平调节、对细菌源分子反应、胶原代谢过程、机械刺激反应、脂多糖反应、白细胞迁移、伤口愈合调控、氧化应激反应等相关性最大；细胞成分中在含胶原蛋白的细胞外基质、纤维状胶原蛋白三联体、膜筏、胶原三聚体复合物、核染色体部分、转录因子复合物、灶性粘连、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等靶点富集相对集中；分子功能中与肽酶调节活性、蛋白酶结合、蛋白质异二聚活性、血小板衍生生长因子结合、转录因子活性、直接配体调节的序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、生长因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合等相关性最大。通过KEGG通路富集分析三七-马齿苋配伍治疗UC作用靶点的通路分布，见图6。KEGG富集最为显著的20条通路主要包括：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、IL-17 signaling pathway、Amoebiasis、Pertussis、Malaria、Complement and coagulation cascades、Relaxin signaling pathway、Rheumatoid arthritis、NF-kB signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Toll-like receptor signaling pathway等，涉及肿瘤、代谢、免疫、炎症等多方面信号转导。

A为生物过程；B为分子功能；C为细胞成分

图6 三七-马齿苋治疗溃疡性结肠炎交集靶点KEGG通路分析

2.6三七-马齿苋配伍治疗UC作用靶点与KEGG关系网络分析 将得到的三七-马齿苋配伍治疗UC涉及的主要通路与对应交集靶点文件导入Cytoscape 3.7.2软件构建“交集靶点-KEGG”关系网络图(见图7)。该网络由57个节点(37个交集靶点节点和20个通路节点)和131条边组成，其中三角形代表通路、椭圆形代表交集靶点，且节点形状越大表示在该网络中所占权重越大。由图可知，IL1B、JUN、MMP9基因和AGE-RAGE信号通路(hsa04933)、TNF信号通路(hsa04668)、癌症中的蛋白多糖通路(hsa05205)、IL-17信号通路(hsa04657)在该网络中起到核心调控作用。

图7 三七-马齿苋治疗溃疡性结肠炎交集靶点-KEGG关系网络图

3 讨 论

中医药在治疗包括UC在内的多种复杂疾病方面具有疗效高、治疗成本低、毒副作用小等优点，在中国已有几千年的历史[8]。本研究根据ADME性质进行初步筛选，得到16个有效生物活性成分，然后预测了这16个有效生物活性化合物的64个交集靶点。进一步GO功能富集分析表明，这些靶点与炎症和免疫相关的生物学过程密切相关，并建立了化合物-交集靶点网络、PPI网络、靶点-通路网络和功能模块网络。这些网络均提示，三七-马齿苋配伍治疗UC的机制可能通过多分子、多途径协同相加作用，发挥免疫和炎症效应来实现。

本研究筛选出的16个有效化学成分大多数具有抗炎和免疫调节作用。例如：槲皮素可以抑制脂多糖诱导的白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-8的产生，从而发挥抗炎作用[9]。相关研究表明，花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸，通过其衍生的二十烷基类化合物代表细胞膜中脂质含量的主要成分，被认为是多种疾病炎症反应和发病机制中不可或缺的介质[10]。有关山萘酚的研究显示，其可显著降低脂多糖诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6、细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的过度产生[11]。此外，豆甾醇和木犀草素都具有显著的抗炎活性[12-13]。

接着利用64个交集靶点进行PPI网络分析，根据网络节点的Degree和Betweenness Centrality筛选出10个Degree大于平均数的靶点，包括JUN、IL1B、RXRA、MMP9、PPARG、IRF1、CTSD、STAT1、NCOA2、CDK1。其中，IL1B可通过促进T细胞的活化和增殖来诱导T细胞介导的自身免疫性炎症，并能同时促进其他炎性细胞因子的表达及中性粒细胞浸润[14]。另外，在JNK途径中JUN可被TNF-α激活，从而在肠炎的发病机制中起重要作用[15]。PPARG也被证实能够下调促炎细胞因子如IL-4、IL-5和IL-6的产生。Vetuschi等[16]报道，PPARG还可以干扰促纤维化分子的生成，如血小板衍生生长因子、IL-1和转化生长因子-β(TGF-β)。这些结果均提示三七-马齿苋配伍可能通过调节抗炎作用和免疫系统来发挥防治UC的作用。

随后，本研究对64个交集靶点进行KEGG通路富集分析，结果表明64个目标可以进一步映射到29条通路。进一步的交集靶点与KEGG关系网络分析提示，三七-马齿苋配伍治疗UC的机制与“IL-17信号通路”和“TNF信号通路”密切相关，且这两条通路均参与免疫和炎症反应。IL-17信号通路作为肠炎发病机制中的关键介质受到广泛关注。IL-17是一种强有力的炎症性白细胞介素，能激活其他促炎细胞因子的表达。IL-17主要由辅助性T细胞(Th17细胞)和其他来源产生，包括自然杀伤细胞、肥大细胞和中性粒细胞[17]。据报道显示，炎性肠病患者外周血单核细胞IL-17水平与疾病严重程度相关[18]。TNF信号通路通过对肠上皮细胞的细胞毒作用改变肠屏障功能，并通过CD14+巨噬细胞共同刺激和激活固有层T淋巴细胞(CD14+细胞膜结合的TNF与固有层T细胞上的TNFR2相互作用)来调节肠道炎症[19]。目前，TNF-α抑制剂是治疗UC的有效抗炎生物制剂[20]。综上，三七-马齿苋配伍可能通过靶向这些抗炎和免疫调节途径来抑制UC的进展。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。