二次玻璃化冻融囊胚对临床结局和新生儿结局的影响

韩潇，毕钡钡，黄鲜菊，胡琳莉

(郑州大学第一附属医院生殖医学中心，郑州 450052)

数十年来，尽管有数百万夫妻从体外受精(IVF)中受益，但辅助生殖技术(ART)对不孕女性的安全性一直备受关注[1]。随着ART领域的重大进步，每个周期可转移的可用胚胎数量也在增加，导致大量多余的胚胎冷冻保存[2]，以备将来进行冻融胚胎移植(freeze-thaw embryo transfer，FET)。既往的研究表明，FET可降低中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)的风险[3]，也可减少控制性卵巢过度刺激(COH)引起的其他副作用[4]，同时也可改善子宫内膜的容受性[5]。通常，我们中心的冷冻周期中，一个冷冻管中保存的胚胎数量不超过两个。多胎妊娠是辅助生殖技术的一个严重并发症，可引起妊娠期高血压、贫血、胎膜早破、早产及产后出血等。而随着我国计划生育政策的变化，倾向于单胚胎移植的夫妇数量在增加，因此，需要再次冷冻保存于同一冷冻管内的胚胎。如果患者的身体状况在胚胎解冻后的移植日不适合进行移植，也需要将胚胎再次冷冻。此外，在胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)周期中再次活检也可能导致胚胎再次冷冻保存。基于胚胎二次冷冻的发生率在逐渐增加，我们有必要评估反复冻融对妊娠结局及新生儿结局的影响。

目前，关于胚胎二次冻融对妊娠结局及新生儿结局的影响研究较少。以往的研究表明，二次冻融胚胎的发育潜能及其对孕产结局的影响仍存在争议[5]。本研究旨在分析二次玻璃化冻融胚胎对冻融单囊胚移植妊娠和新生儿结局的影响，以便为临床医生和患者选择二次玻璃化冻融胚胎提供参考。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1月至2020年4月在郑州大学第一附属医院生殖医学中心行FET的患者病例资料。纳入标准：(1)年龄≤40岁；(2)BMI≤30 kg/m2；(3)行单囊胚移植；(4)输卵管或男方因素不孕症女性；(5)抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml。排除标准：(1)女方供卵、胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)、染色体异常、单基因病；(2)子宫畸形(单角子宫、纵膈子宫、残角子宫、鞍状子宫等)及子宫器质性疾病如宫腔粘连、子宫内膜增生、子宫内膜息肉、≥4 cm的子宫肌瘤、Ⅲ期或IV期子宫内膜异位症；(3)卵巢相关异常如多囊卵巢综合征、卵巢功能不全、卵巢早衰等；(4)任何可能与不良妊娠结局相关的严重合并症，如糖尿病、先天性心脏病、垂体瘤、甲状腺疾病等。行二次冻融及单次冻融囊胚移植的患者均签订了知情同意书。

二、研究方法

1.分组：共纳入1 201例行单囊胚冻融周期移植的患者，根据胚胎经历的冷冻次数，分为双冻组(49例)和单冻组(1 152例)。每个患者均只有一个周期被纳入研究。通过倾向性评分匹配对两组患者进行1∶3匹配，匹配变量包括年龄、基础FSH、不孕类型、治疗方案。匹配后产生双冻组(n=49)和单冻组(n=147)。

2.囊胚培养及评分：取卵16～18 h后根据两个原核的形成来确定受精方式(IVF/ICSI)。第3天将胚胎转至囊胚培养液G2(Vitrolife)中进行囊胚培养。第5天，至少有两名胚胎学工作人员根据Gardner评分系统[6]对囊胚进行评分，在本中心，细胞数为6～10、囊胚评分≥3BB的视为优质囊胚。

3.囊胚的冻融：囊胚的冷冻及解冻分别采用玻璃化快速冷冻、解冻方法。在玻璃化冷冻前，用激光脉冲(OCTAX laser shot，MTG)人工收缩囊胚腔。根据Vit试剂盒(Kitazato公司，日本)的说明，按照传统方法[7]进行玻璃化冷冻和加温。复苏后的囊胚在囊胚培养基中培养3 h，如果一半以上的细胞完整，囊胚腔再次扩张，则视为囊胚存活。

4.内膜准备及囊胚移植：(1)自然周期：对于月经周期和排卵规律的患者采用自然周期方案。在月经周期的第8～11天，使用经阴道超声监测卵泡发育及子宫内膜情况。当优势卵泡直径>14 mm时，测定尿LH水平，当出现尿LH峰值时，测定血清E2、LH和孕酮(P)水平，以确定排卵时间。若优势卵泡直径在18～20 mm之间，但未出现LH激增，则于当日上午给予人绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)10 000 U肌肉注射诱导排卵。排卵后，口服达芙通(苏威制药，荷兰)，10 mg/次，每天2次及肌肉注射黄体酮(浙江仙琚)40 mg，于第6天在B超引导下进行单个优质囊胚移植，移植后继续按原剂量进行黄体支持。(2)人工周期：在月经期或黄体酮撤退性出血的第2～3天开始给予补佳乐(拜耳，德国)2～4 mg/d，通过超声监测子宫内膜厚度，根据血清雌激素水平和子宫内膜情况调整补佳乐的用量，当子宫内膜厚度≥8 mm时，促排卵用药同自然周期，于第6天在B超引导下进行单个优质囊胚移植，移植后继续按原剂量进行黄体支持。

5.妊娠判断：移植术后4～6周，行阴道超声检测见孕囊及胎心搏动，为临床妊娠；若β-HCG阳性(血清β-HCG>5 U/L)而子宫内未见孕囊，但宫腔外可见孕囊者为异位妊娠。

6.分析指标：着床率=孕囊数/胚胎种植数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。小于37周分娩为早产，出生体重低于2 500 g为低出生体重儿。

三、统计学分析

结 果

一、双冻胚胎基本情况

双冻组共解冻50枚囊胚，其中1枚未存活，故其解冻存活率为98.0%。在双冻组的49个移植周期中，其中43个周期为之前的移植周期中同时解冻了同一冻存管内共同保存的两枚胚胎，因患者为瘢痕子宫选择单囊胚移植，二次冷冻剩余囊胚，本次为二次冻融单囊胚移植；5个周期为之前的移植周期中同时解冻了同一冻存管内共同保存的两枚胚胎，因患者宫颈机能不全选择单囊胚移植，二次冷冻剩余囊胚，本次为二次冻融单囊胚移植；1个周期为之前的移植周期中因患者个人原因，术前临时要求取消移植，二次冷冻囊胚，本周期为二次冻融单囊胚移植。

二、两组患者的基本资料

两组患者的年龄、不孕年限、BMI、基础FSH水平、AMH水平、不孕类型、内膜准备方案、移植日子宫内膜厚度均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般资料及内膜情况比较

三、两组患者的妊娠结局

统计结果显示，双冻组与单冻组之间的着床率、临床妊娠率、流产率、异位妊娠率以及活产率均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者临床妊娠结局比较[%]

四、两组患者的新生儿结局

本研究入组患者共有82例活产单胎，其中64例来自单冻组、18例来自双冻组。对比两组活产单胎的新生儿结局，新生儿的男女比例、早产率、出生体重、低出生体重率、新生儿疾病发生率均无统计学差异(P>0.05)；与单冻组相比，双冻组的孕周显著减少(P<0.05)，剖宫产率显著升高(P<0.05)(表3)。另外，单冻组内有一例新生儿疝气患者，两组均无死产或新生儿死亡的报道。

表3 两组患者活产单胎的新生儿结局

讨 论

由于ART的巨大进步，胚胎冷冻保存已成为IVF临床治疗中广泛使用的有效方法，成功的胚胎冷冻保存方法将增加单个卵巢刺激周期中的累积妊娠率。为了减少多胎妊娠的发生率，临床医生及患者对单囊胚移植的选择增加。在本研究中，我们评估了二次玻璃化冻融胚胎对冻融单囊胚移植妊娠和新生儿结局的影响，结果显示：二次玻璃化冷冻组(双冻组)与单次玻璃化冷冻组(单冻组)之间的着床率、临床妊娠率、流产率、异位妊娠率、多胎妊娠无统计学差异，两组间新生儿的性别比例、早产率、新生儿出生体重、低出生体重率、新生儿疾病发生率也无统计学差异(P>0.05)；双冻组的剖宫产率显著高于单冻组，双冻组的孕周显著低于单冻组(P<0.05)。

胚胎的质量被认为是影响胚胎发育潜力的重要因素，并且在胚胎着床中起着至关重要的作用[8]。早期对于胚胎重复冷冻影响的评估主要集中于小鼠胚胎。Fathi等[9]发现，小鼠胚胎的重新玻璃化冷冻不影响胚胎的存活率和囊胚形成率，但会显著减少内细胞团细胞数量和囊胚直径。Vitale等[10]的结果显示，小鼠胚胎经历三次冻融后的细胞数量显著少于未经冷冻的胚胎，但冻融胚胎仍能存活三个连续的冻融周期，并且可以在体外发育。Ling等[11]认为，胚胎细胞数目的减少并不意味着随后胚胎体外或体内发育能力的下降。同样地，Sheehan等[12]的研究也表明，再次玻璃化冷冻对小鼠胚胎着床前发育及着床潜能影响不大。

随后的一些研究评估了人类胚胎经历二次冷冻后对于胚胎发育潜能及妊娠结局的影响。Murakami等[13]和Zheng等[14]比较了重新玻璃化冷冻胚胎移植与初次冻融胚胎移植的临床结局，结果表明，两次冷冻保存组的流产率显着高于对照组。而Kumasako等[15]的研究指出，重复玻璃化冷冻组和对照组孕妇的着床率、临床妊娠率及流产率均无统计学差异；Cobo等[16]的研究也发现，二次玻璃化冷冻胚胎移植周期的胚胎存活率、着床率和临床妊娠率与新鲜周期相当；Check等[17]的研究也表明，使用二次冷冻的胚胎不会降低植入率，我们的结果与其研究一致。我们发现，Murakami等[13]和Zheng等[14]的研究均使用了两种冷冻保存方法，即缓慢冷冻然后玻璃化冷冻，而Kumasako等[15]和Cobo等[16]及我们的研究的两次冷冻方法均为玻璃化冷冻。不同的冷冻保存方法可能是造成结果之间差异的原因。学者柏海燕等[18]发表的一篇关于中途胚胎植入前遗传学诊断/筛查(Midway PGD/PGS)病例报道中报道了一名因行Midway PGD/PGS而接受二次冻融囊胚移植患者的妊娠结局，该患者获临床妊娠，孕39周剖宫产一男婴，体重3 000 g，发育正常。2018年中华医学会制定的关于冷冻胚胎保存时限的中国专家共识指出[19]，胚胎冷冻保存对FET妊娠率以及子代出生缺陷率没有显著影响。Nagy等[20]的研究表明，与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻对胚胎的损伤更小，可以显著地提高胚胎的存活率，从而提高累积妊娠率及辅助生殖的安全性，并且玻璃化冷冻技术的实施，也促进了患者对选择性单囊胚移植的接受。

有研究发现，相对于不分质量的双囊胚移植，移植单个优质囊胚可显著改善种植率，并极大地降低多胎率[21]。在患者条件及胚胎质量适合的情况下，单囊胚移植是一个更优选择。评估胚胎经历二次冷冻后进行单囊胚移植对临床妊娠及孕产结局的影响，提供患者对先前储存的胚胎进行再冷冻保存的选择可能会鼓励更多患者对移植的胚胎数量采取更谨慎的态度。此外，并非所有的二次冷冻胚胎均会被移植，在我们中心，从2017年1月到2020年4月，根据上述纳入和排除标准进行选择，共有189例患者进行了二次胚胎冷冻，其中135例患者(71.43%)的胚胎仍在保存中，仅有54例患者(28.57%)进行了二次冷冻胚胎移植。

胚胎二次冻融周期中新生儿的健康也是患者非常关心的问题。本研究的49例双冻组患者，其不孕类型均为继发不孕，且有43例因瘢痕子宫行单囊胚移植而二次冷冻了囊胚。研究显示，瘢痕子宫再妊娠选择剖宫产分娩方式的比例高于自然分娩[22]，这也解释了本研究中双冻组的剖宫产率显著高于单冻组这一结果。与自然分娩的分娩时机的不确定性相比，剖宫产可由于母婴因素及母亲的个人选择而人为地确定分娩时机，本研究的结果显示，双冻组的孕周显著小于单冻组的孕周，但双冻组均为剖宫产，故此结果并不能说明二次冷冻胚胎对孕周有不良影响。Murakami等[13]的研究分析了二次冷冻胚胎移植的围产期结局，结果显示，双冻组的平均体重有下降趋势，但其在分析中合并了单胎和双胎。而本研究在分析围产期结局时仅纳入了活产单胎的数据，结果显示，二次冷冻组与单次冷冻组相比，新生儿出生体重、性别比、先天性缺陷之间没有统计学差异(P>0.05)，与Zheng等[14]的研究结果一致。

本研究所纳入的周期均为单囊胚移植周期，并且对年龄、基础FSH、不孕类型、内膜准备方案进行匹配，两组患者匹配后的一般资料均无统计学差异，这更有利于明确胚胎冷冻次数对于妊娠结局的影响。然而，当前的研究也有一些局限性：这是在单个中心进行的回顾性队列研究，并且样本量有限。但该研究仍在一定程度上显示了二次冷冻保存胚胎的妊娠结局及新生儿结局的安全性，为临床决策和患者咨询提供了有价值的信息。

重新冷冻多余的胚胎可以避免患者面临卵巢过度刺激和反复失败的风险。但是，迄今为止，胚胎二次冻融的安全性尚未完全确定。我们的结果显示，胚胎二次玻璃化冻融在一定程度上会缩短孕周，但对着床率、临床妊娠率、新生儿出生体重没有明显的不利影响，并且不增加流产、异位妊娠、多胎妊娠、早产、低出生体重儿、新生儿疾病等不良孕产结局的发生几率，对于因瘢痕子宫及宫颈机能不全而进行二次冻融囊胚移植的患者来讲，是一种较为安全有效的选择。在临床中，要充分告知夫妇二次冻融胚胎的益处及风险，包括对未出生孩子健康的影响。未来研究需要纳入更多的患者并进行长期随访，来确认二次玻璃化冷冻保存程序的安全性。