NLRP7基因纯合突变致家族性复发性葡萄胎

闫有圣，刘春莲，谭亚，杨锴，王一鹏，刘妍，阴赪宏*

(1.首都医科大学附属北京妇产医院产前诊断中心，北京 100026；2.北京妇幼保健院，北京 100026；3.宁夏医科大学总医院生殖医学中心，银川 750004；4.北京大学国际医院妇产科部，北京 102206)

葡萄胎(Hydatidiform Mole，HM)是一种良性的妊娠滋养层疾病，表现为绒毛肿胀和滋养层过度增生，没有正常的胚胎发育。在西方国家HM的发生率为0.03%～0.10%，而在中国和日本HM的发生率为0.20%[1-2]。HM通常是散发的，初次发生HM后，HM再发风险为1%～6%，既往有2次HM妊娠史的孕妇再次妊娠时会有10%左右再次发生HM[3]。复发性葡萄胎(Recurrent Hydatidiform Moles，RHMs)也偶尔发生在家庭多个女性成员中，表现为家族中多个女性成员反复出现HM，也伴多次自然流产、死胎等，被称为家族性复发性葡萄胎(Family Recurrent Hydatidiform Moles，FRHM)[4]。

FRHM是一种常染色体隐性遗传疾病，其病理类型主要表现为完全葡萄胎(Complete Hydatidiform Mole，CHM)。散发性CHM是孤雄来源或者双雄受精的结果，但是家族性复发性的CHM通常是双亲来源CHM(Biparental CHMs，BiCHMs)，即胚胎包含有父源和母源的基因组[5]。有研究发现，RHMs患者中48%～80%存在NLRP7突变，在未检测到NLRP7突变的RHMs患者中有10%～14%检测到KHDC3L突变[6]。为了进一步证实FRHM的遗传学因素，并探索新的NLRP7和KHDC3L突变，本研究对我国北方1个近亲结婚的FRHM家系进行了相关遗传学分析。

资料和方法

一、研究对象

先证者，35岁，女性，回族，因RHMs于2019年8月就诊于宁夏医科大学总医院生殖中心，孕10产0，3次流产物经病理确认为CHM。先证者父母为姑舅亲近亲婚配，共生育7人，其中3女4男。先证者妹妹，28岁，自然流产3次，第3次流产物病理确认为CHM；先证者姐姐，41岁，正常生育2男1女，表现正常；先证者3个哥哥和1个弟弟均正常生育，表现正常，该FRHM家系图谱见图1。该研究经宁夏医科大学总医院生殖医学中心伦理委员会批准，先证者及家系成员均签署知情同意书。

Hom：纯合突变(箭头为先证者)；WT：野生型；Het：杂合突变

二、标本采集及DNA提取

采集先证者及其丈夫、父母、妹妹外周血5 ml，采用乙二胺四乙酸(EDTA)进行抗凝处理。先证者姐姐、哥哥和弟弟采用唾液采集器(厦门致善生物科技)收集口腔脱落细胞。血液标本和口腔脱落细胞均采用血液/细胞基因组DNA提取试剂盒(天根生化)提取基因组DNA，采用NanoDrop2 000(Thermo，美国)进行核酸定量和纯度分析。

三、全外显子组测序分析

采用SureSelect Human All Exon V6试剂盒(Agilent，美国)、Illumina Cluster试剂盒(Illumina，美国)和SBS试剂盒(Illumina，美国)进行全外显子组捕获和建库，在Illumina×10高通量测序平台(Illumina，美国)进行全外显子组测序。全外显子组测序由诺禾致远生物科技公司完成。

四、测序数据分析

测序片段通过BWA软件(V 0.7.9a)与参考基因组(GRCh37/hg19)进行比对，比对结果采用Picard1.115软件去除PCR重复序列，然后进行下游的数据分析。采用 Genome Analysis Toolkit(GATKv3.2)软件进行单碱基变异(SNVs)和插入缺失(InDels)变异分析。采用Ensembl Variant Effect Predictor软件(VEP73)进行变异注释。参考我们前期研究中的生物信息学分析流程进行变异筛选[7]，重点关注与FRHM相关的致病基因：NLRP7、KHDC3L、MEI1和C11ORF80。采用ClinVar、OMIM 和HGMD数据库，用于筛选已知的致病变异，同时采用多种工具预测错义变异的功能以及非编码调控序列的注释，正常人群中的变异频率参考GnomAD数据库[8]。依据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)发布的《序列变异解读标准和指南》[9-10]将变异分为5类：致病性、可能致病性、意义不明确、可能良性和良性。序列变异使用人类基因变异国际命名系统(HGVS)进行变异命名和注释[11]。

五、Sanger测序验证

生物信息学分析获得的候选致病基因NLRP7变异位点c.1374_1375del，在其上下游1kb范围内设计扩增引物，以先证者及其父母的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，获得PCR产物采用BigDye3.1测序试剂盒(ABI，美国)进行测序反应，分别使用上游引物：5′-GTGGGCGCAGATGTCCGTGTTC-3′；下游引物：5′-CCTAATTGCCAAGTCGTGTCTCC-3′进行双向测序，产物经乙醇沉淀法纯化后在ABI 3500DX测序仪(ABI，美国)上进行序列分析。用Chromas2.0和SeqMan7.1软件查看和对比测序结果。

结 果

一、全外显子组测序结果

全外显子组测序产出原始数据为10.9 G，目标捕获区平均测序深度为98×，其中≥1×测序深度下的覆盖度为96.8%，≥4×测序深度下的覆盖度为95.47%，≥10×测序深度下的覆盖度为92.99%，≥20×测序深度下的覆盖度为87.46%，数据量符合实验设计要求。

测序数据经生物信息学分析发现，先证者NLRP7基因(NM_001127255.1)在19号染色体发现了纯合的缺失变异，c.1374_1375delAG，p.Arg458SerfsTer69。在cDNA序列1 374和1 375处连续缺失了2个核苷酸(AG)，导致密码子发生框移，产生了截短无功能的蛋白。变异位点c.1374_1375del位于NLRP7突变热点区域，处于NRPL7蛋白的关键功能域-热蛋白结构域和中央核苷酸结合和寡聚化结构域(NACHT)。该变异在Clinvar和OMIM数据库中未见记录，在HGMD数据库扩展版中检索到该变异致病记录的编号为CD1611720，GnomAD数据库中频率极低为1/6 132。依据ACMG《序列变异解读标准和指南》[9-10]分析发现，该位点的致病性分类为致病性。

二、家系成员突变Sanger测序验证

Sanger测序结果表明，先证者NLRP7基因的变异位点c.1374_1375del为纯合变异，与全外显子组测序分析结果一致。家系成员Sanger测序验证结果表明，先证者妹妹(IV7)和哥哥(IV1)为纯合变异，姐姐(IV2)为野生型，2个哥哥(IV3)和弟弟(IV6)为杂合变异，父母均为杂合变异携带者，符合近亲结婚所致常染色体隐性遗传病的遗传方式(图1、图2)。

Ⅲ1：先证者父亲；Ⅲ2：先证者母亲；Ⅳ5：先证者；Ⅳ1、Ⅳ3和Ⅳ4：先证者哥哥；Ⅳ2：先证者姐姐；Ⅳ6：先证者弟弟；Ⅳ7：先证者妹妹；红色箭头示变异位点所在的碱基

讨 论

FRHM是一种特殊类型的HM，往往呈现为家族性发病、反复流产、死胎或HM，患者一生中几乎无正常妊娠[12]。FRHM属于孟德尔常染色体隐性遗传，即患者父母是正常表型，女性同胞中可以出现相同的患者，但是该病并不累及患者兄弟的配偶，且FRHM家族中男性均可以正常生育。研究显示，FRHM患者的流产组织染色体是双亲来源的，而且同一患者与不同男性结婚后仍然会再发HM，提示FRHM发病原因并非HM本身的染色体异常或者基因突变导致，而可能是由于患者的某些基因缺陷累及受精卵及胚胎[13]。因此在临床上对于RHMs的患者应考虑进行孕妇致病基因的筛查。

本研究中募集了1个近亲结婚的FRHM家系，遗传方式符合常染色体隐性遗传方式。先证者发生10次流产和胚胎停育，其中3次经病理证实的流产均为CHM。先证者父母为姑表亲结婚，生育4男3女，其中先证者和其妹妹均表现为RHMs，该家系符合典型的FRHM。

Murdoch等[14]研究了2个FRHM家系，将致病基因定位在19q13.3～13.4范围的0.65 MB区域内，并在该区域内发现了NLRP7基因突变，并证实家系中存在NLRP7基因突变的女性均为HM患者。有研究进一步证实，NLRP7基因突变是导致FRHM的重要遗传因素[6]。NLRP7属于核苷酸结合域-富含亮氨酸重复序列(NLRP)蛋白家族，包括有3个保守的功能结构域，分别是N端的嘧啶结构域、C端配体结合富含亮氨酸的重复结构域(LRR)和NACHT[15]。已经报道的NLRP7基因致病性变异约有40余种，其中65%致病性变异是蛋白截短突变，其余35%致病性变异是错义突变[16]。在FRHM病例中主要以纯合突变和复合杂合突变为主，在部分散发的RHM病例中也发现了NPRP7基因的单等位基因的杂合突变[17]。

本研究中采用全外显子组测序技术分析发现，先证者存在NLRP7基因纯合变异c.1374_1375del，p.Arg458SerfsTer69，并通过Sanger测序进行验证了先证者和其同患RHM的妹妹为纯合突变，其父母为相同位点杂合突变携带者，进一步明确其父母近亲婚配造成了NLRP7基因(c.1374_1375del)纯合致病变异是导致该家系发生FRHM的病因。Reddy等[18]在1例RHM患者中检测到NLRP7基因c.1374_1375del纯合变异，该患者发生了3次HM，并且多次辅助生殖技术助孕均失败。

有研究显示，NLRP7基因突变导致受精卵有丝分裂抑制因子(p57)的异常表达，表现出类似于三倍染色体所致的部分性HM特征[19]。表观遗传学研究发现，卵母细胞NLRP7基因突变与受精卵早期DNA甲基化和印记基因表达存在密切而复杂的关系，卵母细胞中p57可能驱动了绒毛细胞向HM的转化[20-21]。NLRP7基因纯合突变的女性，通过IVF-ET、卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)和胚胎植入前遗传学诊断(PGD)等辅助生殖技术均无法成功受孕，卵母细胞捐献是目前可获得正常妊娠的重要途径。随着基因治疗技术的发展，未来患者有可能通过基因编辑技术而获得有血缘关系的后代[5]。本研究的FRHM家系中，先证者与其妹妹均为NLRP7基因纯合突变，自然受孕再发HM风险高，建议可通过捐卵获得后代。

NLRP7基因在卵母细胞中高表达，在早期人类胚胎发育过程中可以通过调控p57的表达来调节组织分化和增殖之间的平衡，且不影响精子的发生过程，因此，NLRP7基因纯合变异男性具有正常的生育功能[22]。本研究中的先证者哥哥Ⅳ1经Sanger测序验证为NLRP7基因纯合突变，但其可以正常生育后代，进一步证明NLRP7只会导致女性RHM，对于男性没有影响。

本研究通过对1个罕见的近亲结婚FRHM家系进行遗传学分析，进一步证实NLRP7基因突变是导致FRHM的遗传学因素，并为患者家庭的生育提供指导。