两种外源有机酸对土壤Cd形态及秋华柳Cd积累的影响

綦远才， 周 翠， 何欣芮， 汪 鹏， 魏 虹*

1.三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400715 2.西南大学生命科学学院, 重庆 400715

随着经济和工农业的快速发展，土壤重金属污染日益严重[1]. 2014年《全国土壤污染状况调查公报》指出，我国土壤无机污染物主要有Cd、Hg、As、Cu等8种重金属，而Cd污染点位超标率最高，达7.0%[2]. Cd是一种具有长期性、滞后性和形态多样性等特点的有毒重金属[3]，植物从环境中吸收的Cd在体内富集会引起一系列的生理生化反应，通过影响植物光合作用及呼吸作用等，最终抑制植物正常生长[4-5]. Cd还能通过食物链的传递对人类健康带来潜在风险[6]. 因此，寻找有效途径减轻土壤Cd污染带来的风险非常重要.

与物理和化学修复相比，植物修复技术具有成本低、无二次污染等特点，在土壤重金属污染修复中被广泛应用[7-8]. 随着相关研究的不断深入，研究者发现土壤重金属生物有效性偏低，加之大多数高富集植物生物量较低，在一定程度上影响了重金属污染土壤的植物修复效果[9]. 因此，如何有效提升土壤重金属活性，以及筛选高生物量富集植物成为重金属污染土壤植物修复领域关注的焦点[10]. 低分子量有机酸(low molecular weight organic acids，LMWOAs)广泛存在于植物组织和根际中，土壤溶液中的重金属离子可与其形成螯合物或络合物，提高土壤中重金属的流动性，促进与土壤固相结合的重金属的释放，从而增强土壤中重金属活性[11]. 面对重金属胁迫，植物根系合成分泌的不同低分子量有机酸在根际有机螯合重金属的能力存在差异，主要通过一系列解吸附作用与土壤重金属离子形成不同形态的可溶性络合物，从而影响植物对Cd胁迫的修复效果[12-15]. 研究[16-18]显示，蓖麻、盐肤木等重金属富集植物根系分泌的草酸和酒石酸等低分子量有机酸可酸化根际土壤，但对Cu、Pb等重金属的活化程度存在差异，导致植物修复效果不同. 由此可知，不同工程物种和不同有机酸组合对植物修复的作用存在差异. 因此，有必要进一步探讨外源有机酸对土壤重金属形态和工程植物的植物修复效应特征，这将有助于土壤重金属的植物修复应用和实践.

秋华柳(SalixvariegateFranch.)是杨柳科柳属的多年生灌木，具有发达根系，生物量大，生长繁殖快，且对Cd污染有良好的积累和耐受能力，在Cd污染土壤的植物修复中具有一定的应用潜力[19-20]，但其吸收积累Cd的能力有待进一步提升. 前期研究[21]表明，在Cd胁迫生境中，秋华柳根系分泌以草酸和酒石酸为主的低分子量有机酸，增强了植株对Cd的耐性和吸收. 那么添加外源草酸和酒石酸能否影响土壤中Cd的形态，进而提高秋华柳对Cd的吸收积累能力,以及不同有机酸的影响是否存在差异？鉴于此，该研究设计了盆栽模拟试验，通过添加草酸和酒石酸两种外源有机酸，探究其对土壤中Cd形态的影响及植物对Cd的吸收和积累特征，以期为土壤重金属污染植物修复技术应用提供一定参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年10月在重庆市北碚区嘉陵江河岸(29°41′2″N、106°26′56″E)采集一年生健壮秋华柳实生苗，移入西南大学生态园试验基地，进行生长适应性培养. 2019年4月，将在三峡库区嘉陵江消落带采集的土壤碾碎，过5 mm筛，加入10 mg/kg Cd (CdCl2·2.5H2O)混匀. 根据前期研究结果，10 mg/kg是Cd胁迫对秋华柳造成毒性效应的初始浓度[21]. 保持潮湿平衡1个 月后，将处理好的土壤装入盆钵(高10 cm，下径12 cm，上径14 cm)中，每盆3.5 kg. 试验土壤的基本理化性质如表1所示.

表1 供试土壤基本理化性质

1.2 试验设计

2019年5月，选择健康及长势一致的秋华柳实生苗栽植于盆钵土壤中，并置于试验基地遮雨棚(棚顶透明，四面透风)下，进行常规管理. 20 d后进行外源有机酸(草酸和酒石酸)处理，在秋华柳植株根部周围以滴管方式一次性均匀加入有机酸，对照组加入等量去离子水. 2种外源有机酸各设置2个处理浓度——5和10 mmol/kg. 试验以每2株为一个处理组，每个处理3次重复，试验设计采用完全随机法，各处理组设置见表2. 试验期间进行相同标准的常规田间管理，无施肥，土壤含水量维持在田间持水量的60%～80%. 试验用的盆钵下方有排水孔，浇水过程中存在一定的土壤淋滤液下渗流失现象. 盆钵下方放置不透水塑料托盘，以防止对下方土壤的污染. 60 d 后收获植物全株并采集土壤样品，测定相关指标.

表2 试验处理

1.3 秋华柳生物量的测定

秋华柳全株收获后带回实验室，用自来水冲洗干净后利用超纯水润洗1次，根部用20 mmol/L的EDTA-Na2溶液浸泡5 min，然后迅速用超纯水冲洗干净，所有清洁后的植物根、茎、叶分别放入烘箱，在80 ℃下烘干至恒质量，各器官生物量通过电子天平称量获得.

1.4 秋华柳Cd含量测定

用球磨仪分别将烘干的根、茎和叶样品研磨成粉末，并分别称取0.05 g，加入HNO3(6 mL)-H2O2(2 mL)消解液后用微波消解仪(Speed Wave SW-4，德国)进行消解，用超纯水定容至50 mL，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，Thermo Fisher iCAP6300，英国)测定其Cd含量.

1.5 土壤中Cd形态的提取及含量测定

土壤经自然风干研磨过筛后进行5种Cd形态的提取及其含量测定.

参考Tessier研究方法进行土壤Cd形态提取[22-23]，采用连续分级提取土壤中5种Cd形态——可交换态(EXC)、碳酸盐结合态(CAR)、铁锰氧化物结合态(OX)、有机物结合态(OM)和残渣态(RES). 土壤有效性Cd包括EXC和CAR，土壤非有效性Cd包括OX、OM和RES[24-25]. 各提取态Cd含量均采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，Thermo Fisher iCAP 6300，英国)测定.

1.6 数据分析

利用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析. 对不同处理条件下土壤各形态Cd含量的差异、秋华柳生物量和Cd积累量特征分别进行双因素方差分析(two-way ANOVA)，有显著差异的指标再进行Tukey多重比较. 其中，富集系数和转移系数计算方法如下：

BCF1=M/S

(1)

BCF2=M1/S

(2)

TF1=M2/M3

(3)

TF2=M3/M1

(4)

式中：BCF1为地上部分富集系数；BCF2为地下部分富集系数；TF1为枝-叶转移系数；TF2为根-枝转移系数；M为地上部分平均Cd含量，mg/kg；M1为根平均Cd含量，mg/kg；M2为叶平均Cd含量，mg/kg；M3为茎平均Cd含量，mg/kg；S为土壤中Cd含量，mg/kg.

2 结果与分析

2.1 外源有机酸对土壤Cd形态的影响

不同处理下土壤重金属Cd形态含量的变化特征如图1所示. 由图1可见，与Cd胁迫对照组相比，添加外源有机酸显著降低了土壤总Cd含量(P<0.05)，这与添加有机酸改变了土壤酸碱环境有较大关系. 相比于Cd胁迫对照组，在土壤中分别添加5、10 mmol/kg草酸和5、10 mmol/kg酒石酸后，各处理土壤总Cd含量分别降低了14.0%、14.0%、25.0%、20.1%，可见，酒石酸对土壤总Cd含量的影响更为明显. 各处理下土壤中Cd的主要存在形态均以可交换态、碳酸盐结合态和残渣态为主，添加外源有机酸对土壤中各形态Cd含量有显著影响.

注：图柱右侧小写字母表示不同处理组间土壤中同种形态Cd含量差异显著(P<0.05). RES—残渣态Cd；OM—有机物结合态Cd；OX—铁锰氧化物结合态Cd；CAR—碳酸盐结合态Cd；EXC—可交换态Cd.图1 外源有机酸对土壤中各形态Cd含量的影响Fig.1 Effects of exogenous organic acids on Cd forms in soil

与Cd胁迫对照组相比，添加外源有机酸降低了土壤中铁锰氧化物结合态、碳酸盐结合态和残渣态Cd含量(P<0.05)，显著增加了有机物结合态Cd含量(P<0.05). 酒石酸处理对土壤Cd形态的影响高于草酸处理，且5 mmol/kg酒石酸处理显著增加了土壤可交换态Cd含量，但显著降低了残渣态Cd含量(P<0.05).

土壤中有效性Cd含量的变化直接影响着富集植物对土壤重金属的修复效果. 添加外源有机酸提升了土壤中生物有效性Cd占比，但显著降低了非有效性Cd占比(P<0.05)(见表3). 结果显示，添加外源酒石酸对土壤Cd活化的效果优于草酸.

表3 不同处理下土壤有效性Cd和非有效性Cd的占比

2.2 外源有机酸对Cd胁迫下秋华柳生物量的影响

不同处理下秋华柳地上及地下部分生物量的变化如图2所示. 在整个试验期间，秋华柳生长正常，未表现出明显的Cd生物毒性症状. 与CK相比，添加外源草酸有降低秋华柳生物量的趋势，添加外源酒石酸有增加植株生物量的趋势. 统计检验结果显示，各处理组秋华柳地上生物量与CK没有显著差异(P>0.05)，添加5 mmol/kg草酸显著降低了植株地下生物量(P<0.05).

注：不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05). n=3. 图2 外源有机酸对秋华柳生物量的影响Fig.2 Effects of exogenous organic acids on biomass of S. variegata

2.3 外源有机酸对秋华柳吸收和积累Cd的影响

由图3可见，添加外源酒石酸对秋华柳各器官Cd含量的影响显著高于其他处理. 与Cd胁迫对照组相比，添加5 mmol/kg酒石酸显著增加了秋华柳各器官的Cd含量(P<0.05)，其中根、茎、叶、地上部分和全株Cd含量分别增加了84.4%、79.0%、79.6%、79.3%和81.2%. 添加外源草酸没有明显改变植株各器官的Cd含量，且随着处理浓度的增加，秋华柳根、茎、叶、地上部分和全株Cd含量均呈下降趋势. 该结果表明，添加5 mmol/kg酒石酸能有效促进植物对土壤中Cd的吸收.

由图3可见，添加外源酒石酸明显增加了秋华柳各器官Cd积累量，添加外源草酸则降低了秋华柳Cd积累量. 与Cd胁迫对照组相比，添加5 mmol/kg酒石酸下，秋华柳根、茎、叶、地上部分和全株Cd积累量显著提升(P<0.05)，分别增加了75.9%、85.9%、68.7%、62.2%和78.4%，表明秋华柳对Cd污染土壤的修复能力得到了明显增强.

注：不同小写字母表示不同处理组间秋华柳Cd含量差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示不同处理组间秋华柳Cd积累量差异显著(P<0.05). 图3 外源有机酸对秋华柳各器官Cd含量及积累量的影响Fig.3 Effects of exogenous organic acids on the Cd contents and accumulation in organs of S. variegata

不同有机酸处理对秋华柳根、茎和叶Cd含量及其积累量的方差分析结果如表4所示. 由表4可见，有机酸种类对秋华柳根、茎、叶、地上部分及全株Cd含量都有极显著影响(P<0.01)，有机酸浓度以及有机酸种类与浓度的交互作用对秋华柳根、茎、叶及全株Cd含量有显著影响(P<0.05)或极显著影响(P<0.01). 有机酸种类对秋华柳根、茎、叶、地上部分及全株Cd积累量有显著影响(P<0.05)或极显著影响(P<0.01)，有机酸浓度对秋华柳茎Cd积累量有显著影响(P<0.05)，有机酸种类与浓度的交互作用对秋华柳根、茎及全株Cd积累量有显著影响(P<0.05)或极显著影响(P<0.01).

表4 秋华柳各器官Cd含量及其积累量的方差分析

2.4 外源有机酸对植物修复效应的影响

各处理下秋华柳对Cd的富集系数和转移系数如表5所示. 结果显示，与Cd胁迫对照组相比，添加外源有机酸整体提升了秋华柳的富集系数，但对根-枝与枝-叶转移系数未产生明显影响. 添加5 mmol/kg酒石酸显著提升了秋华柳地上和地下部分的富集系数，分别提升了173.0%和178.8%. 与Cd胁迫对照组相比，添加外源草酸对秋华柳的富集系数和转移系数无显著影响.

表5 外源有机酸对秋华柳Cd积累的影响

3 讨论

3.1 外源有机酸对土壤Cd形态的影响

植物对土壤重金属的去除效率在很大程度上取决于土壤重金属的生物有效性[26]. 研究结果显示，与Cd胁迫对照组相比，外源有机酸处理组显著降低了土壤总Cd含量，并提升了土壤重金属生物有效性含量. 已有研究[27-28]发现，低分子量有机酸可使土壤酸化，酸性环境下重金属可从相对稳定状态转变为易被植物吸收的有效态，从而提升土壤中有效性重金属含量和植物富集重金属的效率，增强植物修复重金属污染土壤的潜能. 不同分子结构的有机酸对重金属形态的影响存在差异[29-30]. 该研究中，酒石酸处理对土壤Cd形态的影响显著大于草酸处理，且酒石酸处理下土壤Cd有效性含量高于草酸处理，促进了与酒石酸络合的重金属被植物吸收、转运及积累，这与Cui等[31-32]的研究结果相一致.

研究土壤重金属赋存形态变化为分析重金属生物有效性提供了重要信息[33]. 在外源有机酸作用下，土壤Cd形态的积极显著变化促进其生物有效性形态含量增加，秋华柳对Cd的富集系数和转移系数也呈增加趋势，说明添加外源有机酸活化了土壤有效性Cd(如可交换态Cd等). 有效性Cd更易被秋华柳根部吸收，并在植物组织中转移，提高了Cd在植物体内的积累和根茎之间的移动性. 添加外源酒石酸对土壤Cd形态的影响显著高于添加外源草酸的影响，表明不同有机酸对土壤重金属活化程度不同，从而使植物修复潜力存在差异. 从分子结构看，酒石酸为2,3-二羟基丁二酸，草酸是最简单的二元酸(见图4). 酒石酸氧化性强于草酸，这可能是2种有机酸对土壤重金属活化程度表现出差异的重要原因. 与草酸相比，酒石酸具有更多含氧基团，能与Cd2+结合，并释放更多的H+，加速游离态Cd向可交换态和有机物结合态Cd转化，同时也影响了土壤中可变电荷位点的正电荷，如铁锰氧化物结合态Cd结合位点减少，从而降低了铁锰氧化物结合态Cd含量，以及促进碳酸盐结合态Cd向可交换态Cd转化、残渣态Cd向其他形态Cd转化，使土壤中有效态Cd含量增加，增强了秋华柳根部吸收转移Cd的能力[34-35]. 因此，秋华柳对Cd污染修复效果在一定程度上取决于土壤Cd的形态，而酒石酸对秋华柳积累和存储Cd的过程中具有重要作用.

图4 酒石酸和草酸分子结构Fig.4 Molecular structure of tartaric acid and oxalic acid

3.2 外源有机酸对秋华柳富集和积累Cd的影响

秋华柳对Cd具有较高的耐受性和较强的调节能力[36]. 研究结果显示，10 mg/kg Cd胁迫没有明显影响秋华柳地上、地下生物量，植株生长良好，体现了秋华柳较高的Cd耐受能力. 有机酸虽能活化土壤中重金属、降低重金属毒性、促进植物吸收，但重金属积累在植物体内会抑制植株光合效率、破坏细胞壁、延缓植物生长[37].

低分子量有机酸是重金属的有机配体，可通过参与土壤重金属的吸收和积累等过程，促进土壤重金属植物修复[38]. 但不同种类的低分子量有机酸对植物富集重金属的影响存在差异[39]. 该研究结果表明，在添加外源酒石酸下，秋华柳对Cd的富集和积累量显著高于添加外源草酸下秋华柳对Cd的富集和积累量. 添加外源酒石酸对秋华柳吸收和富集Cd具有显著效果，酒石酸具有成对的羧基和羟基依附在碳原子上，能与重金属形成稳定的环状结构；而草酸结构简单，形成的重金属螯合物不稳定，活化重金属潜力较弱[40]. 已有研究[41-42]表明，添加外源酒石酸能促进富集植物修复重金属污染土壤的主要原因在于，添加酒石酸会增加外界环境中H+浓度和Eh，促进重金属从土壤胶体解吸后转入土壤溶液，使土壤有效性Cd含量增加，有利于秋华柳根部吸收活化Cd. 酒石酸还可通过促进秋华柳体内酶和非酶抗氧化剂以及某些耐受基因表达来减轻Cd的毒性，以维持细胞正常形态，增强秋华柳对Cd污染土壤的修复能力[43]. 此外，添加外源有机酸促进了土壤中可交换态Cd含量的增加，使秋华柳根部对重金属的富集量及根茎对重金属的转移系数增加，可促进植物地上部分对重金属的生物萃取能力，有利于提高植物富集系数，降低迁移系数，使植物能在逆境环境中生存. 该研究发现，添加外源草酸虽然降低了土壤总Cd含量，但与Cd胁迫对照组相比，并未提升秋华柳Cd含量及积累量，这可能与草酸活化的Cd更易被土壤微生物富集等因素有关，从而导致秋华柳Cd积累量降低，但尚需后期做进一步深入研究.

除不同有机酸种类处理效果表现出差异外，添加外源酒石酸对土壤重金属的修复效应还表现出高抑低促的浓度效应. 该研究中，添加5 mmol/kg酒石酸对土壤Cd形态及秋华柳Cd富集及积累量、富集系数和转移系数均高于添加10 mmol/kg酒石酸处理. 已有研究[28]发现，在植物体内酒石酸在酶作用下能转化为琥珀酸，琥珀酸有助于Cd在植物体内的转运，但Cd胁迫在一定程度尚会降低酶活性，使酒石酸在植物体内堆积，过量酒石酸可能导致植物毒害，降低根系吸收土壤中的重金属，从而降低植物对土壤重金属的吸收. 因此，较低浓度的酒石酸在秋华柳修复Cd污染土壤中可发挥更重要的作用.

4 结论

a) 与外源草酸相比，添加外源酒石酸对土壤Cd形态的影响更显著，其中添加5 mmol/kg酒石酸可显著增加土壤可交换态Cd含量，降低土壤残渣态Cd含量，增加土壤生物有效性Cd含量.

b) 与Cd胁迫对照组和草酸处理组相比，添加5 mmol/kg 酒石酸可显著增加秋华柳各器官的Cd含量和积累量及富集系数，显著增强秋华柳修复Cd污染土壤的能力.

c) 外源添加5 mmol/kg酒石酸可应用于秋华柳对Cd污染土壤的植物修复实践.