紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞活性和沉默信息调节因子6(SIRT6)表达的影响△

徐丽珲 郭玉 伏等弟 蔡莲君 芦晓红 罗明秀 姚青

年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种与年龄密切相关的不可逆性致盲性眼病[1]。通过流行病学调查人们预测，到2040年全球约2.88亿人患AMD[2]。目前AMD病因尚不明确，可能与遗传、高龄、环境等因素有关，而长期慢性紫外线辐射是不容忽视的重要诱导因素，已被国内外许多流行病学调查和实验研究所证实[3-4]。紫外线对眼内各种组织，如结膜、角膜、虹膜、晶状体及视网膜等均有不同程度的损伤。自然界中的紫外线，尤其是波长为290～320 nm的中波紫外线，还可穿过角膜、房水被晶状体吸收，导致细胞中活性氧自由基(ROS)产生过多，促进了AMD的形成[5]。研究显示，随着紫外线单次照射剂量增加，视网膜凋亡细胞亦增加，视网膜损伤程度与紫外线辐射剂量呈正相关性[6]。沉默信息调节因子6(SIRT6)属Sirtuins家族成员，具有ADP核糖转移酶活性[7]。研究发现，SIRT6通过促进LC3II/I、beclin1和ATG5的表达，显著抑制脂多糖诱导的人视网膜色素上皮细胞发生炎症、氧化应激和细胞凋亡，而SIRT6的过表达可以抑制AKT通路的活化，增强氧化应激，促进ROS的生成，导致神经元细胞受损[8]。既往研究发现，SIRT6与视网膜老化有关[9]，但其在AMD中的作用尚未完全清楚。本研究探讨紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)活性和SIRT6表达的影响，为探讨AMD的发病机制提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和主要试剂ARPE-19细胞(北京协和细胞资源中心)。DMEM高糖培养基、2.5 g·L-1胰蛋白酶、PBS(美国Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)，BoneBotTMCCK-8细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒(上海贝博生物科技公司)，BCA蛋白含量检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒(中国凯基生物技术股份有限公司)，β-actin多克隆抗体(中国Bission公司)，SIRT6多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 紫外线波长及照射剂量计算利用紫外线照度计设定超净工作台紫外灯管发射的紫外线波长为200～290 nm，峰值为254 nm，灯管垂直下方40 cm处的紫外线指数为110 μW·cm-2，照射剂量(mJ·cm-2)=紫外线指数(μW·cm-2)×时间(s)，各组细胞分别照射0 s、67.5 s、135.0 s、270.0 s、540.0 s、1080.0 s、2160.0 s，对应的照射剂量为0 mJ·cm-2、7.5 mJ·cm-2、15.0 mJ·cm-2、30.0 mJ·cm-2、60.0 mJ·cm-2、120.0 mJ·cm-2、240.0 mJ·cm-2。

1.2.2 细胞培养从液氮罐中取出细胞冻存管置37 ℃水浴，融化后将细胞悬液转入离心管后1000 r ·min-1离心5 min，弃上清，再加5 mL体积分数10%的胎牛血清，随后置入含0.1 U·L-1青霉素和链霉素混合液的DMEM完全培养基中，吹打混匀后接种于25 cm2培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱，等4～8 h细胞贴壁后，在显微镜下观察细胞形态，次日更换培养液。

1.2.3 细胞形态学观察将细胞融合度达75%的细胞用胰蛋白酶消化进行传代，待传代后的细胞融合度再次达70%后，将细胞随机分为对照组(0 mJ·cm-2)及7.5 mJ·cm-2、15.0 mJ·cm-2、30.0 mJ·cm-2、60.0 mJ·cm-2、120.0 mJ·cm-2、240.0 mJ·cm-2照射剂量组，吸去培养液，换成无色PBS后，将细胞置于超净工作台紫外灯下方垂直40 cm处，除对照组外，各照射剂量组按照射剂量分别照射67.5 s、135.0 s、270.0 s、540.0 s、1080.0 s、2160.0 s。照射结束后，将PBS换成完全培养基继续放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养24 h，随后用倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.2.4 CCK-8法检测细胞存活率将对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，1000 r ·min-1离心5 min，弃上清，加2 mL完全培养基吹打混匀，细胞计数板计数，调整细胞密度为1×108个·L-1，每孔1×104个细胞(100 μL)接种于96孔板中，每组设5个复孔，继续培养24 h，按相应照射剂量进行处理后继续培养细胞1.5 h，用酶标仪测450 nm光密度(D)，并计算细胞存活率，细胞存活率=(D实验组-D对照组)/(D对照组-D空白组)，实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测细胞SIRT6蛋白的表达按不同照射剂量处理细胞后，收集各组细胞，用冰PBS洗两次，吸干净PBS后加全蛋白裂解液，振荡30 s，冰上裂解5 min，重复5次后在4 ℃下12 000 r ·min-1离心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行定量，以80 μg/12 μL体系进行聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，湿转至PVDF膜上，经50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h，加入适量SIRT6(11000)和β-actin(15000)一抗，4 ℃过夜。用TBST缓冲液洗膜后，按110 000加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，洗膜后用ECL试剂显影。

1.2.6 免疫荧光染色对SIRT6进行细胞定位检测将对数生长期的细胞消化后，按每孔2×105个细胞密度将细胞接种于6孔板，24 h后用照射剂量为30.0 mJ·cm-2、240.0 mJ·cm-2的紫外线分别照射细胞，同时设对照组。照射完毕继续培养细胞24 h，PBS洗3次，用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，Triton X-100处理20 min，山羊血清封闭30 min，加入适量的SIRT6一抗(1250),放入4 ℃冰箱过夜，二抗孵育1.5 h后PBS洗3次，加DAPI试剂孵育5 min后再用PBS洗3次，加抗荧光淬灭封片剂，在暗室下应用日本Olympus倒置荧光显微镜采集图像。

1.3 统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，两组间差异采用t检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 不同照射剂量紫外线对ARPE-19细胞形态和细胞存活率的影响紫外线照射后，显微镜下可见对照组ARPE-19细胞呈梭形贴壁生长，边界清楚，连接紧密，细胞状态良好(图1A)； 30.0 mJ·cm-2照射剂量组ARPE-19细胞形态不规整，细胞数量略有减少，细胞间连接疏松(图1B)，而240.0 mJ·cm-2照射剂量组ARPE-19细胞几乎不能完全贴壁，细胞数量显著减少，且细胞变圆或脱落(图1C)。CCK-8检测结果显示：与对照组相比，ARPE-19细胞在不同剂量紫外线照射后，细胞存活率均显著降低，且呈剂量依赖性(均为P<0.05，图1D)。

图1 不同照射剂量紫外线对ARPE-19细胞形态和细胞存活率的影响(×100)A：对照组细胞形态；B：30.0 mJ·cm-2照射剂量组细胞形态；C：240.0 mJ·cm-2照射剂量组细胞形态；D：不同照射剂量紫外线对ARPE-19细胞存活率的影响。

2.2 不同照射剂量紫外线及不同干预时间对ARPE-19细胞中SIRT6表达的影响与对照组相比，除较低照射剂量组(7.5 mJ·cm-2、15.0 mJ·cm-2)外，其余各组SIRT6蛋白相对表达量均降低，且随着照射剂量的增加呈剂量依赖性逐渐降低(均为P<0.05)。依据细胞形态及CCK-8检测结果，选取30.0 mJ·cm-2作为后续实验的紫外线照射剂量。用30.0 mJ·cm-2照射剂量干预ARPE-19细胞，分别培养0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后提取总蛋白，Western blot检测结果显示：经过30.0 mJ·cm-2紫外线照射后，ARPE-19细胞随着再培养时间的延长，细胞中SIRT6蛋白的相对表达量逐渐下降(均为P<0.05)(见图2)。

图2 不同照射剂量和时间紫外线照射ARPE-19细胞后SIRT6蛋白表达情况A：不同照射剂量紫外线对ARPE-19细胞中SIRT6蛋白表达的影响；B：30.0 mJ·cm-2紫外线照射不同时间对ARPE-19细胞中SIRT6蛋白表达的影响。与对照组相比，*P<0.01，**P<0.001。

2.3 各组ARPE-19细胞SIRT6的免疫荧光染色结果对照组、30.0 mJ·cm-2照射剂量组和240.0 mJ·cm-2照射剂量组SIRT6主要表达于ARPE-19细胞核内；与对照组相比，30.0 mJ·cm-2照射剂量组和240.0 mJ·cm-2照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6的荧光强度显著降低，且240.0 mJ·cm-2照射剂量组降低更明显(图3)。

图3 对照组、30.0 mJ·cm-2照射剂量组和240.0 mJ·cm-2照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6的免疫荧光染色结果(×100)

3 讨论

视网膜色素上皮细胞在光感受器和脉络膜毛细血管吸收光能、运输代谢物和营养物质方面起着至关重要的作用[10]。视网膜色素上皮细胞变性是AMD发病的重要原因。Del Priore等[11]发现，随着年龄的增加，黄斑区视网膜色素上皮细胞的凋亡也随之增多，视网膜色素上皮细胞内溶酶体系统的活性与年龄呈正相关，年龄的增长启动了溶酶体系统，进而导致了视网膜色素上皮细胞的损伤。人眼内视网膜色素上皮细胞能够为视网膜光感受器细胞提供代谢支持。人在视物时黄斑始终处于光照之下，研究表明，光线的长期照射会使眼内的ROS浓度升高，原有的生理平衡被打破，光感受器外段最先受到ROS的攻击[12]。光损伤和氧化损伤使视网膜细胞受损、凋亡，进而导致 AMD的发生和发展。太阳光中的紫外线是周围环境中紫外线的主要自然来源，其波长范围为200～400 nm,其中，短波紫外线(200～280 nm)具有较为强烈的致突变作用[13]，但穿透能力较弱，一般用作生活和实验研究中的紫外灭菌灯。本研究采用紫外线照射ARPE-19细胞后，照射剂量组细胞形态不规整，细胞间连接疏松，对照组细胞呈梭形贴壁生长，边界清楚，连接紧密，细胞状态良好；进一步CCK-8检测结果显示，与对照组相比，ARPE-19细胞在不同剂量紫外线照射后，细胞存活率显著降低且呈剂量依赖性。

SIRT6又被称为“长寿蛋白”，人类SIRT6基因主要定位于细胞核内[14]。SIRT6是一种多功能蛋白，参与多种细胞过程，包括细胞增殖、凋亡以及细胞周期调节和细胞分化等，而且 SIRT6基因表达的失调与肿瘤、神经系统疾病和心血管疾病等多种疾病有关[15]。敲除SIRT6 基因可导致视网膜内细胞过度凋亡，因此SIRT6已被证实为正常视网膜功能的重要调节因子[16]。我们前期工作也发现，SIRT6蛋白在高糖培养的人晶状体上皮细胞中的表达随着葡萄糖浓度的增加逐渐下降[17]，推测它可能是糖尿病性白内障晶状体上皮细胞损伤的关键靶基因之一。研究表明，SIRT6 通 过 抑 制 Bach1 促 进 Nrf2/ARE 信号转导，进而启动抗氧化防御系统，缓解H2O2诱导的视网膜神经节细胞凋亡和氧化损伤[18]。此外，SIRT6对氧化应激有反应，在DNA双链断裂位点处通过ADP核糖体化促进DNA的修复[19]。紫外线可直接损伤DNA，继而形成碱基二聚体，或者可破坏不稳定性位点的糖基，造成DNA单双链断裂、交联或DNA与蛋白质交联等。本研究显示，随着紫外线照射剂量的增加，ARPE-19细胞中SIRT6的相对表达量逐渐下降；固定紫外线照射剂量为30.0 mJ·cm-2进行照射不同时间后也出现了同样的改变；进一步用免疫荧光染色发现，SIRT6表达于细胞核内且随着照射剂量增大，荧光强度减弱，以上结果均提示紫外线诱导细胞内DNA损伤与SIRT6表达下降有关。因此，SIRT6可能是紫外线致ARPE-19细胞损伤的关键靶点之一，其确切的分子机制还有待进一步研究。