逊克县边疆俄罗斯民族村蜱携带斑点热群立克次体的调查

付维明 哈尔滨海关（黑龙江，哈尔滨，150010）

焦 丹 黑河海关（黑龙江，黑河，164300）

丁淑丽 鞠文东 徐 宁 耿 聪 程 成黑龙江国际旅行卫生保健中心（哈尔滨海关口岸门诊部） （黑龙江，哈尔滨，150001）

黄 洋 黑龙江省森工总医院（黑龙江，哈尔滨，150001）

在黑龙江省北部，紧靠黑龙江南岸，逊克县城区以东12.5km 处的中俄边境线上，有一个富有传奇色彩的村落——边疆俄罗斯民族村，是国家民委批准的首个俄罗斯民族村。 国家对少数民族的健康十分重视，同时，边疆俄罗斯民族村又是旅游热点地区，前来旅游参观的全国各地的游客络绎不绝。 因此，掌握该地区的蜱携带病原情况，对保证俄罗斯民族村的村民健康及蜱传疾病的防控，有着重要的政治意义和医学意义，

1 材料与方法

1.1 蜱类样本的采集

2017 年4-6 月间，在逊克县奇克镇边疆俄罗斯民族村（黑龙江省逊克县奇克镇东）境内针阔混交林中以布旗法捕获活蜱，并记录捕捉日期、生境及其生物学特征。

1.2 DNA 提取及PCR 扩增

将蜱在液氮下研磨至粉末状，采用细菌基因组DNA 提取试剂盒 （由天根试剂公司生产） 提取DNA，具体操作按照说明书进行。 以DNA 为模板，利用斑点热群立克次体 （SFGR）3 种不同目的基因的特异性引物进行PCR 扩增（表1），经PCR 产物进行回收与纯化，送到吉林库美生物公司测序。 所测序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI）网上序列进行同源行比较，用Mega6 软件中的Algnment 进行同源性（distance）和进化树分析（phylogeny）。本研究采用的参考毒株序列均取自GenBank。

表1 文中所用引物

2 结果

2.1 蜱类监测结果

本次调查共捕获蜱类418 只，经分类鉴定分属于硬蜱属（Ixodes）的全沟硬蜱（Ixodes persuleatus）和血蜱属（Haemaphysalis）的嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）。 其中全沟硬蜱286 只，嗜群血蜱132 只。

2.2 SFGR 检测结果

在所有蜱中共检出SFGR 核酸阳性样本93 例，感染率为22.25%（93/418）。 其中在全沟硬蜱中检测阳性样本62 例，感染率为21.68%（62/286）， 嗜群血蜱中检测到阳性样本31 例， 感染率为23.48%（31/132）。

2.3 SFGR 序列对比结果

经SFGR 3 种不同目的基因测序对比， 确定所有样本均属于同一种SFGR， 且为日本立克次体（Rickettsia japonica）， 所测序列均已上传至NCBI，所测得17kDa 基因（MH385342）与Rickettsia japonica（AP017572.1、AP017582.1） 等相似度达99.07%，所测得gltA 基因（MH385343）与Rickettsia japonica（AY743327.1、KX987343.1）等相似度达100%，所测得ompA 基因 （MH385342） 与Rickettsia japonica（DQ909072.1）相似度达99.61%。 所测序列与Gen-Bank 中序列进行同源性比较并构建系统进化树见图1-3。

图1 基于斑点热群立克次体17kDa 基因片段构建的系统进化树

图2 基于斑点热群立克次体gltA 基因片段构建的系统进化树

3 讨论

日本斑点热（JSF）属于SFGR 传染性疾病，是以蜱类为传播媒介的急性热性发疹性疾病。 1984 年，JSF 首次发现于日本的德岛地区［4］，Rickettsia japonica 作为SFGR 的一员，是JSF 的特异性病原体。 在日本的西南部和中部以及韩国均出现过已被确诊的JSF 患者［5］，患者多伴有发热、淋巴结肿大及斑疹性皮疹等典型的临床症状。

图3 基于斑点热群立克次体ompA 基因片段构建的系统进化树

蜱是Rickettsia japonica 主要的储存与传播宿主， 在日本，R.japonica 至少可以在8 种蜱中分离到，包括台湾革蜱（Dermacentor taiwanensis）、豪猪血蜱（Haemaphysalis hystericis）、具角血蜱（H.cornigera），褐黄血蜱（H.ava）、长角血蜱（H.longicornis），台湾血蜱（H.fromosensis）、大刺血蜱（H.megaspinosa）和卵形硬蜱（Ixodes ovatus）［6］；在韩国，研究者同样在长角血蜱中分离到了Rickettsia japonica［7］；在泰国东北地区，一种人类致病SFGF 与Rickettsia japonica 存在密切相关联系（同时在泰国北部地区的豪猪血蜱（Haemaphysalis hystericis）中同样检测到了该病原体）。在日本，Rickettsia japonica 经常可以在台湾革蜱 （Dermacentor taiwanensis） 和豪猪血蜱（Haemaphysalis hystericis）未饱血的幼虫中分离到［8-9］。 通过本研究，我们可以看出，Rickettsia japonica 同样可以在嗜群血蜱及全沟硬蜱中检测到。

在本研究中，研究者利用SFGR 17kDa、gltA 和ompA 基因对分离的SFGR 进行分析，结果显示3 种基因均与Rickettsia japonica 相似度达99%以上，确定为Rickettsia japonica， 感染率可达到22.25%（93/418），可以明显看出Rickettsia japonica 为该地区存在的主要病原体，而且Rickettsia japonica 在全沟硬蜱和嗜群血蜱中的感染率分别为21.68%和23.48%， 说明该种SFGR 在该地区蜱种上的分布也较为平均，差异不大。 研究者在以往对黑龙江地区SFGR 的 调 查 中 发 现［10］，黑 龙 江 主 要 存 在 的 是3 种SFGR，分别是劳氏立克次体（R.raoultii）、新塔拉塞维奇立克次体（Candidatus R.tarasevichiae）和黑龙江立克次体（R.heilongiangii），劳氏立克次体处于一个更为优势的地位， 而且在有的地区感染率还非常高， Rickettsia japonica 的检出对黑龙江蜱携带SFGR 的研究提供了新的提示。

总之，本次检测结果显示，Rickettsia japonica 体存在于黑龙江，虽然还没有人感染该立克次体的报道，但很明显，该地区的Rickettsia japonica 在蜱中的感染率较高，应对该地区的野生动物及常住人群进行血清学检测， 以便更为清楚地了解Rickettsia japonica 在该地区的流行情况。