石墨烯-聚乙烯亚胺分子印迹电化学传感器检测土霉素

王 慧, 高 原, 韩 双

(沈阳化工大学 理学院， 辽宁 沈阳 110142)

土霉素(oxytetracycline，OTC)属于四环素类，是一种广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体等具有抑制或杀菌作用.由于其成本较低，被广泛应用到畜禽养殖和水产养殖业，导致含有OTC的废水被大量排放到水体和土壤中.OTC性质极其稳定，在自然环境中不易被降解，可长期存在于水体和土壤中，对生态环境产生潜在危害.若人类长期食用残留OTC的食物，可能产生抗药性，从而危害身体健康[1-4].

目前，检测OTC的方法主要有高效液相色谱法[5-6]、毛细管电泳法[7]、酶联免疫法[8]、分光光度法[9],以及不同方法的联用技术[10]等.电化学方法是测定OTC的方法之一，因成本低廉、操作简单、灵敏度高而受到广泛关注.

分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)是一种多学科交叉的新型分子识别技术，能够专一识别、吸附目标分子，完成从复杂底物中分离富集某一特定痕量待测物的目的[11].分子印迹技术具有较高的灵敏度和选择性，其在生物毒素、农药残留、违规添加剂的检测分析中得到广泛应用.分子印迹聚合物(MIPs)具有较强的特异性分子识别能力，且耐高温、高压及酸碱腐蚀[12]，在制备不同功能的传感器方面，已得到广泛应用.

石墨烯由于其独特的二维平面结构和优异的导电性[13-15]，使其成为一种理想的负载材料.聚乙烯亚胺(PEI)分子链上大量的氨基和亚胺基与水分子形成很强的氢键，是目前已知的具有最高电荷密度的阳离子聚合物[16].

本文利用石墨烯和聚乙烯亚胺制备的复合材料(RGO-PEI)修饰玻碳电极，以OTC为模板分子，邻苯二胺(OPD)为功能单体，采用电聚合方法制备OTC分子印迹聚合物薄膜，基于此构建了检测OTC的分子印迹电化学传感器.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

OTC、氯霉素(CAP)、盐酸金霉素(CTC)和盐酸多西环素(DHC)，上海阿拉丁生化科技有限公司；纳米石墨粉，Sigma-Aldrich公司；K3[Fe(CN)6]，山东西亚化学有限公司；无水乙醇，辽宁嘉城精细化学品有限公司；冰乙酸和无水乙酸钠，天津博迪化工股份有限公司；OPD、PEI、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和KCl，国药集团化学试剂有限公司.所有试剂均为分析纯.实验用水为二次蒸馏水.

CHI660E电化学工作站，上海辰华仪器有限公司.电化学测量采用三电极系统：工作电极为玻碳电极(GCE，直径5 mm);参比电极为饱和甘汞电极(SCE);对电极为铂电极.UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司.NICOLET-6700型红外光谱仪，美国THERMO FISHER公司.

1.2 实验过程

1.2.1 RGO-PEI的制备

采用改进的Hummers法制备氧化石墨(GO)固体[17].超声，配成GO水溶液.取20 mL 该溶液，加入1 mL 0.1g/mL 的PEI溶液，95 ℃反应2 h.冷却，离心,在60 ℃下烘干沉淀，配成1 g/L 的RGO-PEI溶液，超声混合均匀.

1.2.2 RGO-PEI/GCE修饰电极的制备

将GCE在抛光布上分别用1.0、0.3、0.05 μm氧化铝粉末抛光至镜面，依次用乙醇和二次蒸馏水各超声清洗3 min，氮气吹干.将RGO-PEI溶液超声15 min,混合均匀，滴涂到GCE表面，室温晾干，待用，得到RGO-PEI/GCE修饰电极.

1.2.3 OTC分子印迹和非分子印迹薄膜电极的制备

将RGO-PEI/GCE修饰电极浸入含有5.0 mmol/L OPD和1.0 mmol/L OTC模板分子的0.2 mmol/L 醋酸盐缓冲溶液(pH 4.8)中.采用循环伏安方法进行电聚合，在0～0.8 V的电位区间内扫描 30 圈，扫速为 0.05 V/s.扫描结束后取出电极，在无水乙醇中浸泡10 min进行洗脱，除去分子印迹薄膜中的OTC模板分子,即得到OTC分子印迹聚合物薄膜电极(MIP OPD/RGO-PEI/GCE).

OTC非分子印迹聚合物薄膜电极和OTC分子印迹聚合物薄膜电极的制备过程相同，只是在电聚合时，电聚合溶液中不加入OTC模板分子.

1.2.4 电分析检测OTC

将MIP OPD/RGO-PEI/GCE置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] / 0.1 mol/L KCl溶液中，采用线性扫描伏安法检测洗脱掉模板分子OTC后的峰电流(I0)，扫描电压范围为- 0.2～0.6 V，扫描速率为0.05 V/s.然后将电极置于不同浓度的OTC磷酸缓冲溶液中吸附10 min，取出电极，用二次蒸馏水淋洗电极，洗掉电极表面上可能吸附的物质.将电极再次置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl溶液中进行线性扫描，记录峰电流(I).两次峰电流的差值ΔI(ΔI=I0-I)和OTC的浓度在一定范围内呈现线性关系.

2 结果与讨论

2.1 RGO-PEI的表征

2.1.1 紫外-可见光谱表征

如图1所示，GO的紫外-可见光谱在230 nm处出现一个较强的吸收峰，这是GO的特征峰.RGO-PEI的吸收峰波长出现在270 nm.跃迁峰红移，说明PEI成功将GO还原成RGO，氧化石墨烯共轭电子结构得到恢复.

图1 RGO-PEI、GO的紫外可见光谱吸收曲线

2.1.2 红外光谱表征

图2是GO和RGO-PEI红外光谱图.GO在1 627.21 cm-1处的峰值对应的是COOH的 C===O基团的伸缩振动峰.经过PEI还原并共价键合后，RGO-PEI在1 653.24 cm-1附近的峰值明显减弱，在2 923.93 cm-1附近出现了PEI分子中的CH2—的一对对称和反对称的伸缩振动吸收峰，1653.24 cm-1附近的峰分别对应PEI分子中的C—N基团和N—H基团的伸缩振动吸收峰.表明PEI已经成功修饰到了RGO表面.

图2 GO与RGO-PEI的红外谱图对比

2.2 OTC分子印迹薄膜的电聚合过程

图3(a)为在模板分子OTC存在下，OPD在RGO-PEI/GCE上的电聚合循环伏安曲线.通过循环伏安扫描，功能单体OPD在RGO-PEI/GCE表面发生电聚合，同时裹挟着模板分子OTC沉积在电极表面.OPD的循环伏安曲线只有氧化峰，由此可见，其电化学聚合是一个不可逆的过程.随着扫描的进行，峰电流逐渐减弱.30圈后，电流下降到背景值并趋于稳定.这表明电极表面形成了低导电性的致密聚合物薄膜，阻止了OPD的进一步氧化，使得氧化峰电流受到抑制.图3(b)为不加入模板分子OTC的OPD电聚合循环伏安曲线，与图3(a)相比并无明显变化.这表明OTC的存在不影响OPD的电聚合过程.

图3 OPD的电聚合循环伏安曲线

2.3 OTC分子印迹薄膜的电化学表征

图4是不同电极在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] /0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图.在裸GCE上有一对明显的氧化还原峰(曲线a)，峰电流较大.这是由于K3[Fe(CN)6]在电极表面发生了氧化还原反应.在RGO-PEI/GCE修饰电极上，K3[Fe(CN)6]的氧化还原峰电流变大了(曲线b).这是由于RGO-PEI具有较好的导电性和高的比表面积.然而，RGO-PEI/GCE修饰电极在OPD溶液中电聚合之后，K3[Fe(CN)6]的氧化还原峰完全消失(曲线c).说明OPD在电极表面聚合生成了低导电性的致密聚合物薄膜，从而阻碍了探针K3[Fe(CN)6]扩散到电极表面，进而抑制了电子转移.将该电极在乙醇溶液中洗脱之后，曲线d的K3[Fe(CN)6]的峰电流与曲线c的K3[Fe(CN)6]的峰电流相比明显增大.这表明聚OPD薄膜上的OTC模板去除之后，留下空穴，为探针K3[Fe(CN)6]提供了传质通道，有利于其扩散到电极表面发生电子转移.利用洗脱后的电极吸附一定浓度的OTC溶液，K3[Fe(CN)6]在该电极上的峰电流降低(曲线e)，说明OTC被吸附至电极表面，一部分印迹孔穴被吸附的OTC阻塞，使探针K3[Fe(CN)6]的传质通道减少，所以峰电流下降.

图4 不同电极在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图

2.4 反应条件的优化

2.4.1 电聚合圈数的优化

在制备MIP OPD/RGO-PEI/GCE过程中，电聚合扫描圈数影响着该电化学传感器的灵敏度.因此，实验制备了一系列的电聚合圈数不同的MIP OPD/RGO-PEI/GCE.如图5所示，随着电聚合扫描圈数的增加，相同浓度OTC引起的K3[Fe(CN)6]的氧化还原峰电流下降.当电聚合扫描圈数达到30圈时，电流响应比值达到了最低.电聚合扫描圈数的进一步增加会在电极表面得到更厚的聚合物分子印迹膜，使得待测物更难接近印迹点.因此，选择30圈作为最佳电聚合扫描圈数来进行下面的实验.

图5 电聚合圈数对MIP OPD/RGO-PEI/GCE的影响

2.4.2 pH的优化

磷酸盐缓冲溶液的pH对MIP OPD/RGO-PEI/GCE传感器检测OTC具有明显的影响.为了考察这种影响，传感器在pH为3.0～9.0的磷酸盐缓冲溶液配制的OTC溶液中进行吸附.如图6所示，当pH从3.0到7.0时，OTC的电流响应比率增加；当pH由7.0到9.0时，OTC的电流响应比率降低.这是由于pH较低时，OTC的NH2和聚OPD的NH2均质子化带正电，导致二者之间存在静电排斥作用，OTC不易被吸附，所以检测OTC时的电流响应比率较小；当pH为7.0时，OTC和聚OPD呈中性，静电排斥作用下降，使得检测时出现一个大的电流响应.因此，选用pH为 7.0的磷酸缓冲溶液作为吸附OTC的介质.

图6 pH对MIP OPD/RGO-PEI/GCE的影响

2.4.3 洗脱时间的优化

为了获得较好的灵敏度、选择性和重现性，从聚OPD膜中脱除模板分子OTC是非常重要的步骤.实验选用无水乙醇做洗脱液.结果表明：随着洗脱时间的增加，对相同浓度OTC的响应电流逐渐增大；当洗脱时间为10 min时，响应电流趋于平稳.因此，最佳洗脱时间选择10 min.

2.4.4 吸附时间的优化

吸附时间是影响OTC响应电流的一个重要的因素.洗脱之后，将电极在固定浓度的OTC溶液中吸附10 min.图7显示：K3[Fe(CN)6]峰电流响应比率随着吸附时间的增加而减小，10 min之后趋于平稳.这表明了分子印迹膜对OTC的快速识别能力.因此，最佳的吸附时间选择10 min.

图7 吸附时间对MIP OPD/RGO-PEI/GCE的影响

2.5 传感器的分析性能

2.5.1 OTC的检测

在最优的实验条件下，将脱除模板分子的印迹电极放入含有一定浓度的OTC溶液中吸附10 min，取出电极，用二次蒸馏水淋洗干净，置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] / 0.1 mol/L KCl溶液中进行线性伏安扫描，检测峰电流.由图8可知：随着OTC浓度的增大，分子印迹膜中越来越多的印迹空腔被相匹配的OTC占据，K3[Fe(CN)6]峰电流降低，继而ΔI增大.将ΔI与OTC浓度作图，得到测定OTC浓度的标准曲线(图9).OTC在1.0～100.0 μmol/L范围内与ΔI呈线性关系，线性方程是ΔI=-9.476 16-0.043 63c，回归系数R2是0.995 92，OTC的检出限是0.33 μmol/L (3σ).

图8 MIP OPD/RGO-PEI/GCE传感器在不同浓度OTC溶液中的线性扫描伏安曲线

图9 MIP OPD/RGO-PEI/GCE传感器在不同浓度OTC溶液中的标准曲线

2.5.2 传感器选择性和重现性

CAP、DHC、CTC和OTC同为四环素类抗生素，它们的结构中都含有羟基，能与OPD形成氢键，故进行选择性实验.如图10所示，150 μmol/L 的CAP、DHC、CTC对检测30 μmol/L 的OTC的影响不大.可见OTC分子印迹传感器的选择性良好.在最佳检测条件下，同一支电极对30 μmol/L 的OTC溶液平行测定10次，电流响应的相对标准偏差为2.75 %，表明此传感器的重现性良好.

a c(OTC)=30 μmol/L

2.5.3 实际样品分析

为研究此传感器对实际样品的分析能力，对湖水进行了OTC加标回收率实验.用湖水分别配制5.0 μmol/L和30.0 μmol/L OTC溶液，经电极吸附后，置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] / 0.1 mol/L KCl溶液中检测，测定结果如表1所示.实验得到的回收率为100.4 %～102.6 %，相对标准偏差为4.2 %～4.4 %，可满足实际样品分析的需要.

表1 湖水样品中OTC的加标回收率

3 结 论

研究采用一步还原法合成了石墨烯-聚乙烯亚胺复合材料.利用该复合材料修饰电极，通过原位电聚合OPD获得了OTC的分子印迹聚合物薄膜，成功构建了OTC分子印迹电化学传感器.电流信号随着OTC浓度的增大而增大，在一定范围内电流信号与OTC浓度成线性关系.石墨烯-聚乙烯亚胺复合材料为电极提供了较高的比表面积和丰富的氨基，有利于提高检测灵敏度和分子印迹膜的稳定性.相比于其他检测方法，此传感器制作简单、灵敏度高、重现性好，无需复杂的前处理过程，实现了对湖水样品中痕量OTC的高灵敏高选择性检测，具有一定的应用前景.