NOX2/4在肺纤维化发病机制中的作用

王波 李万成

作者单位：610500 四川 成都，成都医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科

肺纤维化(Pulmonary fibrosis, PF)是一种慢性、进行性的纤维化性肺部疾病，其发病机制与氧化应激有关；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，也称NOX家族，是在生物膜上传递电子的蛋白质，其主要的生物学功能是生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)[1]。ROS是正常细胞代谢的产物，作为第二信使而为人所知，其主要功能是调节信号转导和基因表达[2]。尽管ROS具有重要的生理功能，但当ROS水平超过机体抗氧化能力时，就会发生氧化应激，导致器官功能障碍[1]。正常的肺稳态需要细胞内和细胞外氧化剂和抗氧化剂之间的适当平衡，但在异常情况下，如吸烟、石棉纤维、药物和辐射等，会刺激人体肺组织产生过多的ROS，使氧化剂产生和抗氧化防御失衡，从而导致肺纤维化的发生[3]。尽管目前肺纤维化的发病机制尚未完全明了，但氧化应激已是肺纤维化发生的一项重要机制。本文将对NOX2/4在肺纤维化发病机制中的作用进行综述，旨在找到治疗肺纤维化的新靶点。

ROS的产生、种类及功能

NOX2/4的生物化学结构及功能

NOX包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，其中与器官纤维化相关的主要是NOX2和NOX4。NOX2与NOX4均包含一个同源COOH末端的黄素蛋白结构域(由一个NADPH结合区域和一个黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合区域组成)以及一个疏水NH2末端结构域(由6个跨膜侧螺旋结构组成，其中4个血红素结合组氨酸位于第三和第五跨膜结构域)，其主要功能是生成ROS；并且其异构体的激活均涉及到与跨膜蛋白p22phox形成异源二聚体[1]。NOX2，也被称为gp91phox，是由两个大小相等但性质截然不同的主要域组成的。氨基端部分包括6个跨膜胞内螺旋，并由5个环连接，其中有3个环是细胞外环，有2个环是细胞内环[8]。NOX2与跨膜蛋白p22phox组成非活性异源二聚体。NOX2/p22phox复合物的激活需要4个细胞质亚基，即p47phox(组织者)、p67phox、p40phox和Rac1或Rac2的转位酶；NOX2在吞噬细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)中大量表达，结构细胞(间充质细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和气道上皮细胞)中也有少量表达[1]。NOX4具有组成活性，其结构与NOX2相似[8]；NOX4的578个氨基酸序列与NOX2(gp91phox)有39%的同源性，在跨膜区域以及血红素、FAD和NADPH的结合位点上具有相对高度保守的基序,NOX4与膜蛋白p22phox形成异二聚体复合物，可增强其ROS的生成活性。在肺中，NOX4广泛表达于各种类型的细胞中，包括巨噬细胞以及结构细胞(如平滑肌细胞、内皮细胞、间充质细胞和上皮细胞)[1]。

NOX2/4在肺纤维化发病机制中的作用

一、NOX2/4促进肌成纤维细胞活化及细胞外基质沉积

肺纤维化的特征是过量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积在肺间质组织中，而肌成纤维细胞在ECM沉积中则起关键作用[9]；许多研究已经确认肌成纤维细胞是纤维化过程的建立和进展的细胞，纤维化疾病中的肌成纤维细胞起源于多种细胞来源，包括静止的成纤维细胞、循环的CD34+纤维细胞，以及各种类型的细胞(包括上皮细胞和内皮细胞)，其转换过程称为上皮/内皮-间充质(EMT/EndMT)转变；转化生长因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)蛋白家族由多种多效生长因子组成，在胚胎发生、细胞发育和分化、免疫系统发育、炎症反应功能和创伤修复等众多生理过程中发挥重要作用。由于其强促纤维化作用，这些分子也参与了各种人类纤维性疾病的发病机制。TGF-β广泛参与EMT/EndMT转变，而NOX4在此过程中则作为一个重要的下游介质，参与激活静止的成纤维细胞，或者将不同类型的细胞表型转化为激活的肌成纤维细胞；此外，TGF-β也可有效地刺激NOX4基因表达和NOX4蛋白水平[10]；因此，NOX4可通过TGF-β促进EMT/EndMT转变，使多种不同类型的细胞转化为激活的肌成纤维细胞，从而促进ECM沉积。目前已有研究表明，可通过促进蛋白酶体降解抑制NOX4，从而抑制TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化和肺纤维化的发展[11]。此外，NOX4生成的ROS也被证明参与肌成纤维细胞的激活，而且ROS可能有助于纤维原性分子的激活，如TGF-β1；有研究证据表明NOX4生成的ROS在成纤维细胞/肌成纤维细胞分化前的肺纤维化的发病步骤中发挥着重要作用[12]。另外，TGF-β可诱导NOX4表达并依赖于smad信号，提示TGF-β与NOX4表达之间可能存在自我放大的回路，并且通过二甲双胍激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)，可抑制TGF-β诱导的NOX4表达和ROS的产生，从而抑制肌成纤维细胞的激活，减轻肺纤维化[13]，表明NOX4促进肌成纤维细胞的激活可能还与AMPK/smad信号通路有关。目前也有研究指出，介导肌成纤维细胞活化的ROS可来自肺泡巨噬细胞，且依赖于NOX2和NOX4；雷公藤中纯化的二萜环氧化合物TPL可通过下调放射性纤维化小鼠肺泡巨噬细胞中NOX2和NOX4的水平，减轻ROS的产生，从而阻断肌成纤维细胞的活化及减轻ECM的沉积[14]。由此可见，NOX2/4在参与肌成纤维细胞的活化及细胞外基质沉积中发挥着至关重要的作用。

二、NOX2/4促进肺上皮细胞损伤、凋亡

肺上皮细胞损伤在肺纤维化的早期发病机制中起着重要的作用；并且肺泡上皮的损伤和异常修复是肺纤维化开始的关键[15]；尽管上皮细胞在受损时具有自我修复功能，但是持续的上皮细胞损伤可导致肺纤维化的发展。因此，上皮细胞的损伤、凋亡具有重要意义，它不仅会造成肺泡-毛细血管屏障的受损，也会导致肺组织的异常修复而引起肺纤维化。NOX4可通过ROS介导TGF-β1诱导上皮细胞凋亡，并且使用选择性抑制NOX2/4表达的化合物fulvene-5可降低TGF-β1诱导的上皮细胞凋亡，从而减轻肺纤维化；而在此过程中NOX4衍生的ROS被证明是TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞凋亡的重要下游介质。但ROS可能也有上游作用，可通过促进TGF-β1的表达和激活，增加肺纤维化中NOX4和TGF-β1之间的正反馈作用[12]。另外，活化的肌成纤维细胞也可通过旁分泌H2O2介导上皮细胞凋亡；并且其可能通过氧化介导的机制，促进上皮细胞的周期性损伤及异常修复，从而导致器官的进行性纤维化[16-17]。此外，NOX4可能也有直接导致肺泡上皮细胞凋亡的作用[16]。

三、NOX2参与肺部炎症反应

炎症对纤维化的影响是多重的；在感染和损伤后，炎症细胞和损伤组织细胞分泌可溶性介质(其中包括TGF-β)，诱发巨噬细胞和中性粒细胞分泌炎症介质，进一步刺激TGF-β的产生和激活，导致持续的组织修复或器官纤维化。另外，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞也会分泌促炎因子IL-13，而IL-13可刺激成纤维细胞活化和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化从而导致纤维化的发生发展[18-19]。尽管NOX4在肺纤维化的发生发展中具有不可忽视的作用，但有研究表明NOX4不通过调节炎症反应参与肺纤维化的发病机制[12，20]。目前，NOX2依赖的ROS在促进吞噬细胞的抗菌活性和介导炎症反应方面发挥着公认的作用[1]。NOX2异构体广泛表达，且稳定存在于肺中，炎症状态时其数量可明显增多[21]。在囊性肺纤维化发病机制中，NOX2产生的ROS可介导炎症介质的表达，参与囊性纤维化患者肺部早期炎症反应[22]。此外，尚有研究结果表明，结晶二氧化硅诱导的肺纤维化组织中NOX2的表达呈时间依赖性增加，使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)灌胃后小鼠矽肺模型中升高的NOX2水平可明显降低，并且其血浆及肺泡灌洗液中的炎症介质水平也明显降低，提示NOX2可能在肺部炎症和纤维化中发挥重要作用[23]。如上文所述，NOX2需要和调控亚基p47phox、p67phox的结合才能形成有功能的NOX2；而从特发性肺纤维化患者肺泡灌洗液中分离的中性粒细胞显示出p47phox和p67phox表达升高，提示NOX2在特发性肺纤维化患者的炎症反应中具有某种潜在的作用[24]。

靶向NOX2/4药在肺纤维化治疗中的应用前景

尽管吡非尼酮与NAC都具有下调NOX4表达的作用[25]，并且我国在特发性肺纤维化的治疗共识中推荐吡非尼酮联合NAC治疗肺纤维化，但吡非尼酮不良反应多，且发生较频繁[26]；而对于NAC，其局限性更大且疗效不显著，推测其主要原因可能有三：一、是NAC虽可降低NOX4表达，但其对NOX2的影响则较弱，导致其抗氧化能力弱；二、是NAC可能易使ROS 与抗氧化剂相互作用失衡而导致其抗氧化剂效果不明确[25-27]；三、是NAC虽具有一定的抗氧化潜力，但它是一种比谷胱甘肽和大多数其他内源性抗氧化剂和酶弱得多的抗氧化剂，并且易水解为无抗氧化能力的胱氨酸，而且在充满谷胱甘肽的细胞中，其NAC抗氧化能力就会失效[28]。因此，吡非尼酮与NAC在治疗肺纤维化中，均具有较大的局限性。此外，目前也推荐使用尼达尼布用于肺纤维化的治疗，但其不良反应也较常见，而且与吡非尼酮一样，用于治疗重度肺功能障碍的IPF患者，疗效仍未可知[26，29]，且这两种药物在改善患者生活质量和治疗肺纤维化方面的能力均有限[30]。因此，目前亟需寻找一种疗效确切、不良反应少、在体内代谢稳定抗纤维化药物。如本文所述，NOX2/4在肺纤维化的发生发展中发挥了不可忽视的作用，推测NOX2/4可能是治疗肺纤维化的一个关键靶点，因此靶向NOX2/4药在肺纤维化治疗中应具有广阔的应用前景。

综上所述，肺纤维化的发病机制与氧化应激密切相关，NOX2/4通过ROS在促进肌成纤维细胞活化、ECM沉积、上皮细胞损伤、凋亡以及肺部炎症中扮演着重要的角色；因此以NOX2/4为治疗靶点，可能是治疗肺纤维化的一个重要突破口。