慢病毒载体介导的miR-342-3p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭迁移的影响研究

朱亚蕊 时松和 李雪

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的类型，深入了解其生物学机制，开发有针对性的靶向药物对提高晚期或转移性非小细胞肺癌患者的总体生存率具有重要意义[1]。miRNA的异常表达与NSCLC密切相关，研究报道非小细胞肺癌患者的血清样本中miR-342-3p表达显著下调，miR-342-3p的低表达与晚期TNM分期和阳性淋巴结转移密切相关[2]。且miR-342-3p过表达，可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移[3]。核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1(nuclear ubiquitous casein and cyclindependent kinase substrate1，NUCKS1)在DNA损伤反应和代谢中起重要作用，可以用作多种癌症的生物标志物；并与microRNA相关[4]。研究报道miR-137可通过负调控NUCKS1抑制肺癌A549细胞增殖，迁移，并使肺癌细胞对紫杉醇和顺铂敏感[5]。miR-342-3p是否通过调控NUCKS1影响非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭迁移还尚不清楚。因此，本研究旨在探讨miR-342-3p是否通过调控NUCKS1影响非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭迁移。

资料与方法

一、一般资料

2017年5月至2020年5月经手术病理证实的非小细胞肺癌患者30例，其中男21例，女9例，年龄25～78岁，平均59岁。所有患者术前均未进行过放化疗。通过手术切除其肺癌组织，选取癌旁健康的组织作为对照。

二、材料

人正常肺上皮细胞BES2A-2B和肺癌细胞A549、H1299购自美国ATCC；RPMI-1640培养基购自杭州仟诺生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自北京麦瑞博生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒购自上海圻明生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司；MTT试剂盒购自美国Sciencell公司；Transwell小室、Matrigel购自美国BD公司；慢病毒载体pLent-CMV-GFP购自武汉益普生物科技有限公司。

三、细胞转染与分组

人正常肺上皮细胞BES2A-2B和肺癌细胞A549、H1299均用RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。

合成miR-342-3p特异性过表达片段，将其克隆至慢病毒载体pLent-CMV-GFP中，命名为LV-miR-342-3p；将LV-miR-342-3p和阴性对照空病毒载体分别转染至A549、H1299细胞中，记为LV-miR-342-3p组和LV-NC组；未转染任何质粒的细胞作为NC组。

四、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-342-3p和NUCKS1的表达水平

提取癌组织和细胞的总RNA，反转录成cDNA，按照试剂盒说明进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。miR-342-3p和NUCKS1分别以U6和GAPDH为内参，miR-342-3p上游引物序列：5′-TCTCACACAGAAATCGC-3′，下游引物序列：5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；NUCKS1上游引物序列：5′-TGCCCAAACCCAGACTAAAG-3′，下游引物序列：5′-GACCCTTCATCCCCAGATTT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

五、蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，BCA定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜；加入二抗室温孵育2 h，ECL发光液显影，成像后用Quantity One分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参计算目的蛋白相对表达水平。

六、双荧光素酶报告实验检测miR-342-3p和NUCKS1的靶向关系

构建NUCKS1 3′UTR的野生型和突变型荧光素酶表达载体NUCKS1 3′UTR-WT和NUCKS1 3′UTR-MUT，将其分别与miR-342-3p共转染至肺癌细胞中；按说明书检测荧光素酶活性。

七、MTT检测细胞增殖活力

各组细胞分别培养0 h、24 h、48 h、72 h时，每孔分别加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h，加入150 μL DMSO，振荡反应10 min，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(OD)值。

八、Transwell检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移实验：Transwell小室上室和下室分别加入200 μL细胞悬液和600 μL培养液，培养24 h，吸去培养液，用4%多聚甲醛固定后，再用0.1%结晶紫染色，显微镜观察并拍照，计算迁移细胞数。细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入50 μL基质胶Matrigel，凝固后接种细胞，之后同细胞迁移操作。

九、统计学分析

结 果

一、miR-342-3p在非小细胞肺癌组织和非小细胞肺癌细胞系中的表达水平

与健康组织比较，肺癌组织中miR-342-3p表达水平降低(P<0.05)；与人正常肺上皮细胞BES2A-2B比较，肺癌细胞A549和H1299中miR-342-3p表达水平降低(P<0.05)(见表1，2)。

表1 qRT-PCR检测miR-342-3p在非小细胞肺癌组织中的表达

表2 qRT-PCR检测miR-342-3p在非小细胞肺癌细胞系中的表达

二、NUCKS1在非小细胞肺癌组织和非小细胞肺癌细胞系中的表达水平

与健康组织比较，肺癌组织中NUCKS1表达水平升高(P<0.05)；与人正常肺上皮细胞BES2A-2B比较，肺癌细胞A549和H1299中NUCKS1表达水平升高(P<0.05)(见表3、4，图1)。

图1 Western blot检测NUCKS1在非小细胞癌细胞系中的表达

表3 qRT-PCR检测NUCKS1在非小细胞肺癌组织中的表达

表4 qRT-PCR检测NUCKS1在非小细胞肺癌细胞系中的表达

三、miR-342-3p与NUCKS1直接相互作用

TargetScan预测显示miR-342-3p与NUCKS1 3′UTR含有互补的核苷酸序列(图2)。与NC组比较，miR-342-3p组转染NUCKS1 3′UTR-WT载体的细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)(见表5)。

表5 双荧光素酶报告实验

图2 miR-342-3p与NUCKS1的结合位点

四、miR-342-3p过表达慢病毒载体转染非小细胞肺癌细胞对其miR-342-3p表达的影响

与NC组比较，LV-miR-342-3p组A549和H1299细胞中miR-342-3p的表达水平升高(P<0.05)(见表6)。

表6 qRT-PCR检测NC、LV-NC和LV-miR-342-3p转染A549和H1299细胞后细胞内miR-342-3p的表达水平

五、miR-342-3p负调控NUCKS1的表达，通过miR-342-3p的过表达来影响NUCKS1介导的非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和侵袭

与NC组比较，LV-miR-342-3p组A549和H1299细胞中NUCKS1的表达水平降低，细胞活力降低，迁移和侵袭细胞数降低(P<0.05)(见图3，表7-10)。

图3 Western blot检测NC、LV-NC和LV-miR-342-3p转染A549和H1299细胞后NUCKS1在非小细胞癌细胞系中的表达

表7 MTT法检测转染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p转染A549细胞后对细胞活性的影响

表8 MTT法检测转染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p转染H1299细胞后对细胞活性的影响

表9 Transwell小室检测转染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p转染A549细胞后对细胞系迁移和侵袭的影响

表10 Transwell小室检测转染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p转染H1299细胞后对细胞系迁移和侵袭的影响

讨 论

研究报道miRNA参与了肿瘤的进展过程，肝癌组织中的miR-342-3p表达显著降低，与TNM分期、组织学分级和不良的生存率相关，是肝癌预后的独立预测因子[6]。本实验检测了肺癌组织及肺癌细胞A549和H1299中miR-342-3p表达水平，结果显示，miR-342-3p表达水平降低，与其它研究结果一致。研究报道miR-342-3p过表达可抑制肝癌细胞的增殖[7]。miR-342-3p还可抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭[8]。miR-342-3p的异位表达显著抑制了鼻咽癌细胞的增殖，集落形成和侵袭[9]。说明miR-342-3p在多种肿瘤中均有抑癌作用。为研究miR-342-3p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，本实验构建了慢病毒介导的miR-342-3p过表达载体，将其转染至肺癌细胞A549中，结果显示，肺癌细胞A549中miR-342-3p表达水平升高，表明转染成功。且细胞活力降低，迁移和侵袭细胞数降低；表明慢病毒介导的miR-342-3p可抑制肺癌细胞A549和H1299增殖、迁移和侵袭。本实验研究结果表明miR-342-3p在肺癌中同样起抑癌作用。

研究报道miR-342-3p可通过靶向LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1，LASP1)抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖[10]。说明miR-342-3p可通过调控其靶基因影响肿瘤的进展。为进一步研究miR-342-3p影响肺癌的分子机制，本实验通过TargetScan预测显示miR-342-3p可能的靶向结合mRNA，结果显示miR-342-3p与NUCKS1 3′UTR含有互补的核苷酸序列。研究报道NUCKS1在肝癌组织中上调表达，敲低NUCKS1可降低异种移植小鼠模型中Hep3B细胞系细胞活力并减少肿瘤形成[11]。抑制NUCKS1可降低胃癌细胞增殖和侵袭性[12]。说明NUCKS1在肝癌和胃癌中可能起促癌作用，但其在肺癌的作用尚不清楚，本实验检测了肺癌组织以及肺癌细胞A549和H1299中NUCKS1表达水平，结果显示NUCKS1表达水平升高，与在肝癌组织中表达趋势相同，表明NUCKS1可能在肺癌中可能也充当癌基因。此外研究报道miR-142-3p通过靶向下调NUCKS1抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭[13]。说明NUCKS1可受miRNA的调控进而影响肿瘤进展，本实验结果显示，miR-342-3p过表达后NUCKS1表达水平降低；且进一步通过双荧光素酶实验证实了miR-342-3p可靶向调控NUCKS1。提示，miR-342-3p可能通过调控NUCKS1影响肺癌进展。