JNK/MAPK通路在结核杆菌感染的巨噬细胞凋亡、自噬中的作用机制研究

孙万里 郭玉琪 王月 李养军 杨振华 张卫东 曹杨 任云霞

结核病(Tuberculosis，TB)是由致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染所引起的呼吸道系统慢性传染疾病，MTB是一种兼性细胞内寄生菌，机体感染MTB时，诱导巨噬细胞自噬与凋亡，自噬是巨噬细胞清除病原体的一种防御机制[1-3]。因此，深入研究BCG感染引起巨噬细胞凋亡、自噬的作用机制，有助于提高巨噬细胞对药物的敏感性，为结核病治疗靶标的研究提供依据。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一类由脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸活性的蛋白激酶，是介导信号从细胞表面传递到细胞内的重要转导通路之一，在细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生理过程中发挥作用，c-JunN 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)为MAPK通路蛋白之一，目前有多项研究表明 MAPK 信号家族在细胞或动物试验的自噬各阶段发挥重要作用[4-5]。郭伟伟等[6]构建新生大鼠缺血再灌注(I/R)模型，过表达miRNA-138后发现，p-p38/p38、p-c-jun/c-jun 及 p-JNK1/2/JNK1/2显著下调，表明miRNA-138可通过抑制JNK/p38 MAPK通路，抑制大鼠心肌细胞的凋亡，并减轻活性氧损伤，从而保护新生大鼠心肌细胞。赖华毅等[7]研究表明， 鼠伤寒沙门氏菌spvB基因对肠上皮细胞自噬的抑制作用，可能与其对细胞p38MAPK通路的负调控相关。但JNK/MAPK通路对结核杆菌感染的巨噬细胞凋亡、自噬的作用报道较少，因此，本研究通过构建卡介苗菌株(Bacillus calmette guerin,BCG) 感染的巨噬细胞模型，探索JNK/MAPK通路在BCG 感染的巨噬细胞中的作用机制，以期为临床结核病的防治提供理论依据。

资料与方法

一、实验材料

小鼠巨噬细胞 RAW264.7由中科院上海细胞库提供；BCG菌株由上海生物制品研究所提供；JNK抑制剂SP600125 购自Sigma公司；FBS胎牛血清、DMSO、青霉素、链霉素购自美国Invitrogen公司；0.25%EDTA胰酶、RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；Middlebrook 7H10培养基购自美国BD公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒；BCA试剂盒、ECL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio公司；兔抗鼠p38MAPK、JNK、ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2、LC3、Beclin-1、P62单克隆抗体购自美国CST公司，β-actin、HRP 标记羊抗兔 IgG 抗体购自北京中杉金桥公司。

二、实验方法

1 细胞培养与建立细胞感染模型

BCG接种在Middlebrook 7H10固体培养基上培养，调整菌体浓度，RAW264.7细胞调整至相同密度，将对数生长期的细胞按4×106个/mL接种至六孔板中，待各组细胞贴壁且生长状态良好，按照细胞：BCG菌个数=1 ∶10的比例，将BCG加入各组细胞孔内，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

2 细胞干预及分组

实验分为4组，即对照组、BCG组、对照+SP600125、BCG+SP600125，通路抑制剂SP600125组即RAW264.7细胞预先用含10 μmol/L SP600125的培养液预处理1 h后，再将BCG与RAW264.7细胞共培养12h，继续后续实验。

3 实时荧光定量(Real-time quantification PCR，RT-qPCR)实验检测Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA水平

采用实时荧光定量(Real-time quantification PCR，RT-qPCR)检测1.2.3各组细胞及HCV29细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA相对表达量。以β-actin为内参，反应体系为15μL，2×SYBR Mix 8μL，上下游引物各 0.5μL，cDNA模板2μL，去离子水4μL，反应条件：95℃，120s；95℃，30s；60℃，75s；95℃，15s共40个循环，采用2-ΔΔCt法分别计算Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA相对表达量。Bax、Bcl-2、caspase-3、β-actin引物序列(见表1)。

表1 Bax、Bcl-2、caspase-3和β-actin引物序列

4 吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染色观察自噬

吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染色检测各处理组细胞自噬率，将以上各组细胞吸去培养液，PBS洗涤2遍，加入2μL的AO/EB溶液，各含AO、EB的浓度分别为0.1mg/mL，室温避光孵育15min，加入500μL PBS洗涤2～3次，荧光显微镜观察细胞自噬。

5 噻唑蓝比色法(MTT)检测RAW264.7细胞存活率

将各组RAW264.7细胞，每孔加20 μL的MTT溶液，37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL的DMSO，全自动酶标仪490 nm处测定吸光度OD值，实验重复3次，细胞存活率(%)=(OD实验组/OD空白对照组)×100%。

6 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞用0.25%EDTA的胰酶溶液消化细胞，PBS洗涤2～3次后将细胞制成细胞悬液，加入 5 μl Annexin V-FITC 混合均匀，在4℃条件下避光孵育 20 min，再加 5 μL PI 染液，孵育 5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

7 免疫印迹法(Western blotting，WB)检测JNK、p38MAPK、ERK1/2、LC3、Beclin-1、P62自噬相关蛋白表达

收集各组细胞，冷PBS洗涤去除BCG，加入2 ml细胞裂解液使蛋白充分裂解，离心取上清蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，取50μg蛋白加入上样缓冲液沸水煮5min，经SDS-PAGE电泳、转膜后，加5%脱脂奶粉封闭2h，分别加入一抗p38MAPK、JNK、ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2、LC3、Beclin-1、P62和β-actin(1 ∶1 000)，4℃孵育过夜，室温平衡后，TBST溶液漂洗，再加入HRP标记二抗(1 ∶500)，室温避光孵育2h，使用ECL化学发光液暗室曝光显影，凝胶成像系统拍照并对各条带进行灰度分析，分析条带实验结果。

三、统计学方法

结 果

一、 BCG诱导RAW264.7细胞中JNK、ERK1/2、p38MAPK蛋白表达水平

与对照组相比，BCG组RAW264.7细胞中ERK1/2、p38MAPK蛋白表达差异不明显(P>0.05)，JNK蛋白及磷酸化表达水平显著升高(P<0.05)；与BCG组相比，BCG+SP600125组ERK1/2、p38MAPK蛋白及磷酸化水平表达差异无统计学意义(P>0.05)，JNK蛋白及磷酸化水平表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2，图1)。

图1 各组细胞中JNK、ERK1/2、p38MAPK蛋白表达

表2 BCG诱导RAW264.7细胞中JNK、p38MAPK蛋白表达水平

二、JNK/MAPK通路对BCG感染RAW264.7细胞自噬的影响

与对照组相比，BCG组RAW264.7细胞中橘、红色荧光增多，自噬水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与BCG组相比，BCG+SP600125组细胞中橘、红色荧光减少，自噬水平著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 各组RAW264.7细胞自噬(×400)

三、JNK/MAPK通路对BCG感染RAW264.7细胞存活率的影响

与对照组相比，BCG组RAW264.7细胞存活率显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与BCG组相比，BCG+SP600125组存活率著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 NK/MAPK通路对BCG感染RAW264.7细胞存活率的影响

四、各组细胞Bax、Bcl-2、caspase-3表达水平情况

与对照组相比，BCG组RAW264.7细胞中Bax、caspase-3 mRNA表达水平显著升高，Bcl-2 mRNA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与BCG组相比，BCG+SP600125组Bax、caspase-3 mRNA表达显著降低，Bcl-2 mRNA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见表4)。

表4 各组细胞Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表达水平情况

五、 JNK/MAPK通路对BCG感染RAW264.7细胞凋亡的影响

与对照组相比，BCG组RAW264.7细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与BCG组相比，BCG+SP600125组凋亡率著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表5、图3)。

图3 各组RAW264.7细胞凋亡

表5 JNK/MAPK通路对BCG感染RAW264.7细胞凋亡的影响

六、JNK/MAPK通路对BCG感染RAW264.7细胞LC3、Beclin-1、P62蛋白表达的影响

与对照组相比，BCG组LC3、Beclin-1蛋白表达显著升高，P62蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与BCG组相比，BCG+SP600125组LC3、Beclin-1蛋白表达显著降低，P62蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见图4、表6)。

图4 各组细胞LC3、Beclin-1、P62蛋白表达电泳图

表6 各组细胞LC3、Beclin-1、P62蛋白表达情况

讨 论

MTB存在于被感染宿主巨噬细胞内，可通过多种机制对巨噬细胞的凋亡进行调控，巨噬细胞凋亡对于MTB的生存至关重要，影响MTB的发生、发展及预后[8]。自噬是细胞维持自身稳态的一种机制，在免疫反应中发挥重要作用，研究表明，细胞自噬具有清除MTB的作用，因此，研究巨噬细胞的凋亡、自噬，可以进一步明确MTB的致病机制，为MTB的治疗提供新的治疗方向[9-10]。

当机体感染MTB之后，巨噬细胞可以通过自身凋亡以杀死MTB，同时激活邻近未被感染的巨噬细胞，来增强机体对MTB的杀伤力。本研究结果显示，BCG感染巨噬细胞 RAW264.7后，细胞存活率降低，凋亡率升高，Bax、caspase-3表达水平增加，Bcl-2表达水平降低，表明BCG感染促进细胞凋亡，与姬文兰等[11]研究结果一致。自噬是巨噬细胞中固有免疫和适应性免疫的重要组成部分，有利于细胞清除感染的病原体来减轻自身损伤，自噬与凋亡作为程序性死亡的两种方式，二者既相互独立，又紧密相连。LC3是自噬小体标志蛋白，LC3的水平高低可以反映细胞发生自噬的水平， Beclin-1 是抑癌基因 BECN1 表达的自噬相关标志物，p62为自噬活化过程中的一个调节分子，其表达水平与与自噬程度呈负相关[12-13]。本研究结果显示，BCG感染巨噬细胞 RAW264.7后，细胞自噬水平升高，LC3、Beclin-1蛋白表达水平升高、P62蛋白表达水平降低，表明BCG感染增加巨噬细胞 RAW264.7发生自噬。然而BCG感染引起巨噬细胞凋亡与自噬的具体机制尚不清楚。

MAPK通路主要包括胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)，c-JunN 末端激酶(c-JunN -terminal kinase，JUK)及p38激酶(p38 kinase)[14]，在生长因子、细胞因子等刺激下，MAPK可通过苏氨酸/酪氨酸双位点磷酸化激活多种转录因子，对细胞的生长、分化等多项生理过程进行调控，多项研究表明，MAPK信号通路参与了凋亡与自噬的发生[15-16]。尹昭懿等[17]研究表明，中药珍珠梅黄酮纳米粒上调MAPK通路相关分子JNK,下调ERK的活性，抑制人肝癌HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡及自噬。Kang等[18]研究表明，飞燕草素通过诱导自噬和激活JNK/MAPK途径而充当放射增敏剂，从而增强了非小细胞肺癌细胞的凋亡。本研究显示BCG感染的RAW264.7细胞中ERK1/2、p38MAPK蛋白表达差异不明显，JNK蛋白及磷酸化表达水平显著升高，说明BCG感染主要影响RAW264.7细胞中JNK通路，不影响ERK1/2、p38MAPK通路，表明JNK通路在巨噬细胞抗MTB感染中具有重要作用。万敏等[19]研究表明，在异丙肾上腺素诱导的心肌细胞中，盐酸羟考酮能抑制JNK/p38 MAPK信号通路，而促进心肌细胞增殖，减少细胞凋亡，表明抑制JNK/MAPK通路具有抗细胞凋亡的作用。本研究使用通路抑制剂SP600125处理BCG感染的 RAW264.7细胞后，细胞存活率及Bcl-2表达水平增加，Bax、caspase-3表达水平及凋亡率下降，表明抑制JNK通路可减少BCG感染的 RAW264.7细胞凋亡，与先前报道一致。另外，使用通路抑制剂SP600125处理BCG感染的 RAW264.7细胞，细胞自噬水平下降，LC3、Beclin-1蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平升高，表明MAPK家族中的JNK/通路与BCG感染的 RAW264.7细胞自噬有关。

综上，结核杆菌感染可抑制巨噬细胞增殖、诱导巨噬细胞凋亡与自噬，可能与激活JNK/MAPK通路有关。