FSCN1与Vimentin在结肠癌中的表达与意义

邱辉

（新泰市人民医院肿瘤二科，山东 泰安 271200）

结肠癌是发病率、死亡率均较高的消化道恶性肿瘤[1]。我国是结肠癌的高发国家之一，2012年有新发结直肠癌24.5万例及13.9万例结直肠癌相关死亡病例[2-3]，结肠癌易发生转移是导致死亡率较高的重要原因。结肠癌的侵袭和转移涉及多个细胞内、外因素，肿瘤细胞的细胞骨架成分肌动蛋白结合蛋白可能是其中一个重要因素[4]。FSCN1是一种进化上保守的肌动蛋白结合蛋白，参与细胞突起形成与细胞丝状伪足的形成过程，与肿瘤的生长与转移密切相关[5-6]。FSCN1可以促使肿瘤细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），而EMT在肿瘤的侵袭与转移中具有重要作用[7-8]。FSCN1是否通过促进结肠癌细胞的EMT过程进而导致结肠癌侵袭转移，目前尚未见相关报道。Vimentin（波形蛋白）是EMT的标志蛋白，因此，检测人结肠癌及癌旁组织中FSCN1与Vimentin的表达情况，并进一步研究结肠癌细胞中FSCN1与Vimentin的调控关系，可为阐明结肠癌的转移机制提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验资料 人结肠癌细胞株SW-480细胞购自中科院上海细胞库。兔抗人FSCN1抗体（Abcam）、兔抗人Vimentin（CST）、FSCN1-siRNA（Santa Cruz）、Control-siRNA（Santa Cruz）、Lipo6000TM转染试剂（碧云天公司）、SABC免疫组化试剂盒（博士德）、Transwell小室（Corning公司）、Matrigel胶（BD公司）。人结肠癌组织芯片购自西安艾丽娜公司，人结肠癌组织芯片含有结肠癌原发灶和对应癌旁组织，所有患者术前均未行化疗和放疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 SABC法检测结肠癌及癌旁组织中FSCN1与Vimentin的表达情况，具体步骤参照SABC试剂盒说明书进行。采用两级评分法，①阳性细胞计数：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。②染色强度分级：无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕色为3分。当两级评分乘积＞4时为阳性表达。

1.2.2 细胞培养及转染 细胞培接种于六孔板中，在5%CO2、37℃恒温培养箱中培养，细胞转染于六孔板中进行，细胞密度达30%左右，进行FSCN1-siRNA、Control-siRNA转染，具体步骤参考Lipo6000™转染试剂说明书。

1.2.3 实时定量PCR Trizol法提取结肠癌SW-480细胞中RNA，测定RNA浓度，逆转录成cDNA，实时定量PCR检测，反应条件：50℃2 min，95℃10 min；95℃0.5 min，60℃0.5 min，40个循环。运行溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。FSCN1的引物为5’-GCCAGGGTATGGACCTGTCTG-3’和5’-CACGCCACTC GA TG TC AA AGTA-3’，Vimentin的引物为5’-AAATGGCTCGTCACCTTC-3’和5’-AC CTGAGGCTTTGGATTCCT-3’，内参β-actin的引物为5’-AGCGAGCAT CCCCCAAAGTT-3’和5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。

1.2.4 蛋白质免疫印迹 提取细胞总蛋白，BCA法测定细胞蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后100℃变性5 min。进行SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、10%脱脂奶封闭、一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育1 h、荧光显色。采用Image J软件分析灰度值。

1.2.5 Transwell迁移与侵袭实验 Transwell迁移实验：将200μL无血清培养基稀释的细胞（约5万个）加入小室上层，下室加入600μL含血清的培养液；侵袭实验：小室铺有Matrigel胶，将200μL无血清培养基稀释的细胞（约2万个）加入小室上层；培养24 h，取出小室，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，组间比较采用t检验，3组间比较行单因素F分析，计数资料采用χ2检验，相关性采用Spearman分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组FSCN1与Vimentin蛋白的表达情况 FSCN1主要表达于细胞质，其在结肠癌组织中的表达阳性率为51.1%（46/90），而在癌旁组织中无表达，差异具有统计学意义（χ2=69.791，P＜0.001）；Vimentin主要表达于细胞质和细胞核，其在结肠癌组织中的表达阳性率为62.2%（56/90），而癌旁组织中阳性率为20.0%（18/90），差异有统计学意义（χ2=33.136，P＜0.001），见图1。

图1 FSCN1与Vimentin在结肠癌及癌旁组织中的表达情况Figure 1 The expression of FSCN1 and Vimentin in colon cancer and adjacent tissues

2.2 FSCN1与Vimentin在结肠癌组织中的表达及与临床病理参数的关系 FSCN1在结肠癌组织中的表达与性别、年龄无关，与TNM分期、淋巴结转移、分化程度呈正相关；Vimentin在结肠癌组织中的表达与性别、年龄无关，与TNM分期、淋巴结转移、分化程度呈正相关，见表1。

表1 FSCN1、Vimentin在结肠癌组织中的表达及与临床病理参数的关系Table 1 The expression of FSCN1 and Vimentin in colon cancer and their relationship with clinicopathological parameters

2.3 结肠癌组织中FSCN1与Vimentin表达的相关性FSCN1与Vimentin在结肠癌中共同表达阳性者44例，共同表达阴性者32例，FSCN1表达阳性而Vimentin表达阴性者2例，FSCN1表达阴性而Vimentin表达阳性者12例，两者在结肠癌组织中的表达均呈显著正相关（r=0.705，P＜0.001）。

2.4 SW-480细胞中，FSCN1对Vimentin mRNA及蛋白表达水平的影响 Real time-PCR结果显示，SW-480细胞转染FSCN1-siRNA后，FSCN1 mRNA、Vimentin mRNA水平均明显降低，而Blank组（空白组）与Control-siRNA组无明显变化（F=18.88，P=0.003；F=12.073，P=0.008），见图2。

Western blot结果显示，SW-480细胞转染FSCN1-siRNA后，FSCN1、Vimentin蛋白表达水平均明显降低，而Blank组与Control-siRNA组无明显变化（F=10.531，P=0.011；F=9.43，P=0.014），见图2。

图2 FSCN1对Vimentin的mRNA与蛋白表达的影响Figure 2 Effect of FSCN1 on Vimentin mRNAand protein expression

2.5 Transwell迁移与侵袭实验 人结肠癌SW-480细胞分别转染FSCN1-siRNA与Control-siRNA 24 h后，与ControlsiRNA组比较，FSCN1-siRNA组细胞的迁移、侵袭能力均明显降低（t=4.189，P=0.014；t=-5.143，P=0.007），见图3。

图3 敲低FSCN1的表达后对SW-480细胞运动能力的影响Figure 3 Effect of knockdown of fscn1 expression on motility of SW-480 cells

3 讨论

我国作为结肠癌的高发国家之一，大部分患者确诊时已发生淋巴结或者其他脏器转移，进而失去最佳手术时机。因此，阐明结肠癌细胞的转移机制对于结肠癌的诊治具有重要意义。如果发生浸润与转移，肿瘤细胞需要具备一定的运动和侵袭能力，并有相应的形态特征（如伸长、极化、细胞突起的出现等）及细胞之间连接的紊乱[9]。所有上述改变均与细胞骨架（尤其肌动蛋白）的改变和重排有关[10]。作为一种肌动蛋白结合蛋白，FSCN1与肿瘤细胞的丝状伪足形成、细胞粘附及运动迁移等生物学行为有关，进而影响结肠癌等多种肿瘤细胞的侵袭转移[11]。目前FSCN1在结肠癌转移中涉及的具体分子机制尚不明确。

EMT是指上皮细胞在相关因子的刺激下向间质细胞表型转化的过程，上皮细胞发生EMT化后具有间质细胞特性，通过EMT过程，肿瘤细胞可以获得较高迁移、侵袭与降解细胞外基质的能力，从而诱导肿瘤的浸润和转移[12-13]。EMT对于结肠癌发生和发展至关重要，且与结肠癌细胞侵袭转移密切相关[14]。研究证实，FSCN1可以诱导胆管癌细胞的EMT化及参与人鼻咽癌细胞CNE-2的EMT过程[15-16]。因此，推测FSCN1可能通过诱导结肠癌细胞EMT进而促进结肠癌细胞侵袭与转移。Vimentin是EMT化的重要分子标志物，表达上调后肿瘤细胞迁移运动和侵袭能力明显增强，参与了肿瘤侵袭转移等恶性表型[17]。

本研究结果显示，FSCN1与Vimentin在结肠癌组织中均呈高表达，且与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移均呈正相关，说明二者可能与结肠癌转移有关，且两种蛋白在结肠癌组织中表达呈正相关，因此，进一步用siRNA敲低人结肠癌细胞SW-480中的FSCN1表达后发现Vimentin的mRNA与蛋白表达水平明显降低，进而证实了在结肠癌细胞中FSCN1对Vimentin具有正向调控作用。细胞实验也证实FSCN1与结肠癌细胞的侵袭与转移有关，从而推测出FSCN1通过调控结肠癌细胞的EMT进而促进了结肠癌细胞的转移，为结肠癌的诊治提供了新的思路。