肠内免疫微生态营养支持对炎症性肠病大鼠血清炎症因子和肠黏膜Th17A表达的影响

刘伟栋,冯 峰

(河北省儿童医院普外二科,石家庄 050000;*通讯作者,E-mail:feng2326@163.com)

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一种复杂的非特异性慢性、进行性、免疫介导的炎症性肠道疾病,在过去40年内,IBD的发病率逐年上升,发病年龄逐渐变小[1]。IBD在幼儿时期的发病较为罕见,但最近的研究也表明,0-5岁儿童IBD的发病率上升幅度较成年人更大[2]。IBD包括克罗恩病和溃疡性结肠炎两大类[3],克罗恩病多发于结肠及小肠末端,临床表现为腹痛、深肠黏膜溃疡,多伴有肠道狭窄,溃疡性结肠炎则主要发生于结肠及直肠,临床表现为黏液性脓血便、腹泻、肠黏膜溃疡较浅,极少出现肠道狭窄[4]。IBD的发病与遗传易感宿主对环境因素的免疫反应失调有关,抗生素的大量使用、饮食结构的改变、寄生虫感染、食用含有乳化剂及表面活性剂等因素导致肠道微生物及菌群的失衡和改变,最终引发IBD[5]。IBD患者广泛存在营养不良的状况,患者对能量和蛋白质的需求量激增,常规营养支持无法满足IBD患者的需求[6]。肠内营养(enteral nutrition,EN)对于儿童IBD患者的肠黏膜功能的保护作用已经被大量的研究所证实[7],肠内免疫微生态营养(enteral ecoimmunonutrition,EIN)是近些年来新发现的营养支持方式[8],本实验采用EIN对IBD模型幼鼠进行干预,观察其对幼鼠肠黏膜损伤的影响及其调控机制,旨在为IBM患儿的临床治疗提供更多数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)购自美国Sigma公司,批号:P2297。麻醉剂戊巴比妥钠片购自中国医药集团上海化学试剂公司,批号:F20020915。肠内营养混悬液(能全力)购自纽迪希亚制药(无锡)有限公司,批准文号:国药准字H20030012。双歧杆菌三联活菌购自上海信谊药厂有限公司,批准文号:国药准字S10950032。谷氨酰胺颗粒购自成都力思特制药股份有限公司,批准文号:国药准字H20040245。精氨酸购自湖北省潜江市四维氨基酸有限公司,批准文号:国药准字H20058540。兔单多克隆IL-17A一抗购自abcam公司,货号:ab79056。

1.2 实验动物

40只4周龄SD级幼鼠,体质量为60-80 g,购自南京大学实验动物中心。将所有幼鼠置于温度为25 ℃、空气湿度为60%的无特殊病原体(specific pathogen free,SPF)级动物实验中,给予充足的饮食和洁净的水源,适应性喂养3 d后,将幼鼠按照完全随机法分为对照组、模型组、EN组和EIN组,每组10只。对照组10只幼鼠仅进行常规饲养,其余30只SD幼鼠则采用TNBS诱导以构建IBD模型。模型组10只幼鼠给予0.9%生理盐水灌肠,EN组10只幼鼠给予常规肠内营养剂,EIN组10只幼鼠则在肠内营养基础上给予免疫微生态营养支持。

1.3 IBD幼鼠模型的构建

手术开始前对所有幼鼠禁食24 h,但不禁水,手术开始时采用麻醉剂戊巴比妥钠片(30 mg/kg)腹腔注射,待麻醉成功后,先将直径约为2 mm的塑料软管从幼鼠肛门处插入8 cm以方便灌肠。模型组、EN组和EIN组幼鼠采用5%TNBS(20 mg/kg)缓冲液混合50%等量乙醇溶液进行灌肠,对照组则用0.9%等量生理盐水灌肠,持续灌肠20 s后使各组幼鼠保持倒立姿势2 min,当幼鼠表现为腹泻、黏液血便,出现厌食及体质量快速下降症状时视为IBD幼鼠模型构建成功。

1.4 营养干预

待所有幼鼠手术后清醒6 h,对照组幼鼠提供充足的饮水,模型组、EN组和EIN组幼鼠则先以2 ml生理盐水冲洗肠管后,对照组和模型组幼鼠给予常规普通饲料喂养,EN组幼鼠给予125 kJ/kg肠内营养混悬液(能全力),EIN组幼鼠在肠内营养液基础上同步给予109CFU双歧杆菌三联活菌、0.4 g/kg谷氨酰胺颗粒和0.25 g/kg精氨酸,持续喂养7 d,7 d后颈椎脱臼处死各组幼鼠,取结肠组织待用。

1.5 免疫组化检测白细胞介素17A(interleukin 17A,IL-17A)水平

取1.4中各组幼鼠结肠组织,经石蜡包埋后脱蜡处理,梯度乙醇水化后高温高压修复,磷酸盐平衡缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗后H2O2和山羊血清封闭,与兔多克隆IL-17A一抗(稀释比1 ∶1 000)在4 ℃下恒温孵育,PBS冲洗3次后,加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的IgG二抗(稀释比为1 ∶3 000)共同孵育,PBS再次清洗3次,加入二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DBA)染色后用苏木精复染,脱水透明后封片。

1.6 观察指标

分别于造模后第1天及第7天对大鼠体质量进行称重,记录大鼠大便性状及隐血情况,观察大鼠结肠组织病理学特征。收集大鼠腹主动脉血,高速离心后取上清液,采用放射免疫法[9]测定肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的水平。使用Cooper评分对大鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI)进行评估[10],评价标准为:大鼠体质量下降0%时记0分,体质量下降1%-5%时记1分,体质量下降5%-10%时记2分,体质量下降10%-15%时记3分,体质量下降比高于15%记4分。大便性状为正常时记0分,性状呈松散时记1-2分,大便不成型或便稀时记3-4分。隐血记1-2分,血便肉眼可见时记3-4分。DAI总分为体质量下降比、大便形状和隐血得分总和除以3。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、CRP水平变化

造模后第1天各组大鼠血清TNF-α、CRP水平差异无统计学意义(P>0.05),经不同方式营养干预7 d后,与对照组相比,模型组大鼠TNF-α、CRP水平显著升高(P<0.05),而与模型组相比,EN组和EIN组的TNF-α和CRP水平显著下降(P<0.05),且EIN水平更低(P<0.05,见表1)。

表1 各组大鼠血清TNF-α、CRP水平变化

2.2 各组大鼠体质量变化

与对照组相比,模型组大鼠体质量增长值显著下降,而与模型组相比,EN组和EIN组大鼠体质量增长值明显增加(P<0.05),且EIN组增长值更高(P<0.05,见表2)。

表2 各组大鼠体质量增长值

2.3 各组大鼠DAI评分变化

第1天及第7天对照组大鼠DAI评分均为0分,EN组和EIN组DAI评分均显著低于模型组,且EIN组的评分更低(P<0.05,见表3)。

表3 各组大鼠DAI评分变化分)

2.4 各组大鼠结肠组织病理学差异

对照组大鼠肠黏膜结构完整,腺体清晰可见,上皮细胞排列整齐且呈连续性,未观察到炎性细胞浸润和溃疡等炎症反应症状;模型组大鼠肠黏膜结构混乱,腺体模糊,腺腔破坏,上皮细胞排列杂乱,观察到明显的炎症反应症状,具体表现为肠绒毛稀疏,部分上皮细胞脱落,有深浅程度不同的裂隙样溃疡,绒毛水肿萎缩坏死,有明显炎症细胞浸润;EN组大鼠结肠黏膜结构混乱程度有所减轻,可隐约观察到腺体结构,炎症反应症状有所改变;EIN组大鼠结肠黏膜结构较为完整,腺体结构较为清晰,细胞排列有序,且连续性较好,炎症细胞浸润及溃疡等症状基本消失(见图1,2)。

图1 各组大鼠结肠组织病理变化Figure 1 Pathological changes of colon tissues in rats in each group

与对照组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05;与EN组相比,@P<0.05图2 大鼠结肠炎症病理评分Figure 2 Pathological score of colon inflammation in rats after different treatment

2.5 各组大鼠肠黏膜IL-17A水平差异

对照组结肠黏膜组织中IL-17A阳性染色细胞数几乎没有,模型组结肠黏膜组织细胞质中IL-17A阳性染色数明显增多。与模型组相比,EN组和EIN组IL-17A阳性细胞染色数显著减少(P<0.05),且EIN组阳性细胞数更少(P<0.05,见表4)。

表4 各组大鼠肠黏膜IL-17A阳性细胞染色数比较

3 讨论

IBD是以克罗恩病和溃疡性结肠炎为主的特发性慢性胃肠道疾病,IBD疾病隐患从儿童时期开始,难以治愈,对儿童的生长发育、心理健康均造成极大负面影响,约40%的IBD患儿出现生长发育迟缓及青春期延迟情况[11]。IBD的病因尚不明确,现有的研究推测,原发性IBD与遗传因素、免疫失调及肠道微生物群紊乱有关,而继发性IBD则与药物作用、器官移植以及肠道手术等因素有关[12,13]。肠道真菌与微生物共同作用,维持健康人群肠道和机体平衡,肠黏膜是平衡肠道微生态的重要屏障,完整的肠黏膜屏障是抵抗肠源性细菌异位感染的重要方式,肠黏膜受损时机体炎症水平快速升高,肠内免疫微生态失衡,紊乱失衡的肠道真菌及微生物进一步加重IBD患者的病情[14]。因此,维持肠道微生态平衡,保护肠黏膜屏障对于IBD患者的临床治疗意义重大。

有研究指出,皮质类固醇等肠内营养支持疗法治疗IBD患儿效果较好,可以有效保护患儿胃肠道功能,预防和控制疾病相关营养不良,缓解患儿腹泻便血等临床症状,降低发病率和死亡率[15]。肠内免疫微生态营养支持是基于传统营养疗法进行改进的新型营养支持方式,在传统疗法基础上同步给予肠道活菌[16],本次旨在探讨肠内免疫微生态营养支持对IBD大鼠肠黏膜屏障的保护作用及其相关机制。本研究结果显示,肠内免疫微生态营养支持可显著降低IBD大鼠血清炎症因子TNF-α及CRP水平,避免大鼠体质量短时快速下降,改善模型大鼠的DAI评分,保护肠黏膜结构和功能,改善炎症细胞浸润及溃疡等炎症反应。原因在于,肠内免疫微生态营养支持在常规营养支持上添加双歧杆菌三联活菌等益生菌制剂,在肠黏膜表面形成有效的防御屏障,显著提高肠黏膜的通透性,抵抗病原菌入侵,抑制肠黏膜炎症改变,加速肠黏膜愈合,消除炎症反应[17]。因此,肠内免疫微生态营养支持对于IBD模型大鼠肠黏膜功能有显著的保护作用。

从分子角度分析,IBD的发病与肠道微生物的串扰有关,肠道细菌代谢形成的短链脂肪酸影响肠道内外的免疫反应[18],梭状芽孢杆菌等黏附在上皮细胞上的细胞通过调节T细胞分化改变Th17细胞亚群的水平[19],而Th17细胞亚群也被证实参与多种自身性免疫疾病和慢性炎症性疾病的发病机制,IL-17A是Th17细胞释放的特异性效应因子,IL-17A的表达水平越高,机体炎症水平也越高[20]。本次研究指出,肠内免疫微生态营养支持干预可显著抑制IL-17A的表达,从而减轻大鼠机体内炎症水平。推测其原因可能为,添加了活性益生菌的肠内免疫微生态营养干预方式,因益生菌独特的生物活性,可以有效激活免疫反应,下调模型大鼠肠黏膜组织中IL-17A的表达水平,缓解炎症水平,同时加速肠胃蠕动以及多种生物酶的合成,平衡肠道菌群,加速营养物质吸收,帮助增强抵抗力和免疫力[21],最终发挥保护肠黏膜屏障的效应。

综上所述,肠内免疫微生态营养支持对炎症性肠病大鼠肠黏膜功能有较好的保护作用,通过抑制Th17细胞特异性标记物IL-17A的表达,下调炎症因子水平,抑制机体的炎症反应,维持大鼠体质量,改善疾病活动指数评分,对于炎症性肠病大鼠的治疗效果甚佳,为儿童炎症性肠病的临床治疗提供了新的方向。