不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷成分与抗氧化活性分析

侯建华，王劼，周玉碧，武志博

(1.中国科学院藏药研究重点实验室，青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.中国科学院大学，北京 100049；3.阿拉善盟林业治沙研究所，内蒙古 巴彦浩特 750399)

荒漠肉苁蓉(CistanchedeserticolaMa)为列当科肉苁蓉属植物，是我国药食两用的中药材，具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效，素有“沙漠人参”之称[1].荒漠肉苁蓉在我国主要分布于新疆维吾尔族自治区、内蒙古自治区、甘肃省、宁夏回族自治区等[2].近年来由于无节制采伐，使得荒漠肉苁蓉野生资源濒临灭绝，已被纳入《国际野生植物保护名录》[3].现肉苁蓉药材来源主要以栽培为主，内蒙古和新疆地区为其主要产区.由于我国健康产业的迅速发展，以及阿拉善荒漠肉苁蓉已申报为新食品原料，使得药材资源的需求急剧增加.药材资源往往存在道地性，不同产区生产的药材品质存在明显差异[4-5]，因此系统地研究荒漠肉苁蓉能够有效地推动沙生植物资源的可持续开发利用.

已有研究表明，荒漠肉苁蓉中含有多种化学成分，如苯乙醇苷类、多糖类、木质素及其苷类、环烯醚萜类和黄酮类等化合物，其中苯乙醇苷类为其主要活性成分，并具有显著的药理活性特征，松果菊苷和毛蕊花糖苷为其主要指标成分[6-8].研究人员已通过高效液相色谱、超高效液相色谱、质谱和核磁共振等技术对苯乙醇苷化学成分了研究，发现苯乙醇苷成分不仅在肉苁蓉属不同种[9]、同种的不同产地[10]和不同采收时期[11-12]之间存在明显差异，甚至在同种不同个体和不同部位[13]之间也存在差异.综上所述，HPLC技术已成为定性定量分析苯乙醇苷成分的一种常用方法，该方法稳定高效、准确可行.目前对荒漠肉苁蓉的研究主要集中在栽培育种、成分分析和遗传多样性等方面，但对不同产地样品化学成分与抗氧化活性综合对比方面的研究较少.

本研究以新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区和哈萨克斯坦3个产地的荒漠肉苁蓉为研究对象，对不同产地样品中的苯乙醇苷化学成分及样品醇提物抗氧化活性进行分析，为荒漠肉苁蓉药材资源的综合开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

荒漠肉苁蓉样品采集于新疆、内蒙古和哈萨克斯坦地区，在采样过程中，栽培样品在同一产地采集穴数不少于3穴，野生样品同一穴位采样株数不少于3株，同时记录其生境等地理信息.样品经甘肃农业大学孙学刚教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物荒漠肉苁蓉(拉丁学名：CistanchedeserticolaMa)，样品信息见表1.

1.2 试验仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪(LC-10AD，日本岛津公司)；多功能酶标仪(EnSpire2300，珀金埃尔默企业管理上海有限公司)；电子天平(AUW2200，岛津菲律宾工厂)；纯水机(UPH-1-40L，四川优普超纯科技有限公司)；循环水真空泵(天津津腾实验设备有限公司)；超声清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海恒一科学仪器有限公司)；紫外分光光度计(上海科学精密仪器有限公司).

试剂：苯乙醇苷对照标准品(上海源叶生物科技有限公司)、DPPH试剂(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS试剂(2,2′-连氮基-双-3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸二铵盐)、总抗氧化剂能力试剂盒、氢氧化钾、磷酸、磷酸盐缓冲溶液、过硫酸钾、抗坏血酸(VC)、乙腈、甲醇、乙醇、磷酸、浓硫酸、去离子超纯水.

表1 荒漠肉苁蓉样品信息表

1.3 高效液相色谱

1.3.1 溶液的配制 标准品的配制：称取7种苯乙醇苷标准品松果菊苷、肉苁蓉苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷和管花苷B适量，用50%的甲醇溶液溶解，配制成一定浓度的对照品溶液.

样品溶液的制备：对采集的荒漠肉苁蓉样品进行标记、清洗、干燥、粉碎后过200目筛.称取样品0.2 g，加入10倍量体积50%甲醇溶液，称重，静置浸泡30 min，超声提取45 min，冷却后称重，用50%甲醇溶液补足失重，以4 000 r/min的速度离心20 min，收集滤液，使用前用0.45 nm微孔滤膜过滤后测试分析.

1.3.2 色谱条件的选择 色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18 column)，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为330 nm，进样量为2 μL.以0.1%磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱：0～10 min，16%～22.3%(B)；10～12 min，22.3%～23%(B)；12～16 min，23%～26%(B)；16～23 min，26%～30%(B).

1.3.3 方法学试验

1.3.3.1 精密度 在所设定的色谱条件下平行测定同一标准品(管花苷A)6次，计算其含量分别为0.489、0.492、0.488、0.487、0.489、0.493 mg/mL，平均值为0.490 mg/mL，RSD值为0.502%.

1.3.3.2 稳定性 分别在0、2、4、6、8、12、24 h，平行测定同一荒漠肉苁蓉样品6次，以松果菊苷样品含量为依据，分别计算其含量依次为2.822、2.849、2.823、2.752、2.784、2.785和2.791 mg/mL，平均值为2.801 mg/mL，RSD值为1.157%.

1.3.3.3 重复性 平行制备同一荒漠肉苁蓉醇溶液6份，在所设定色谱条件下测定样品溶液6次，以肉苁蓉A样品含量为依据，分别计算其含量依次为0.244、0.248、0.244、0.235、0.242、0.244、0.244 mg/mL，平均值为0.243 mg/mL，RSD值为1.546%.

1.4 体外抗氧化试验

1.4.1 溶液的配制 醇提物的制备：称取样品10 g，加入8倍量体积70%的乙醇溶液，冷凝回流提取两次，每次3～4 h，以10 000 r/min的速度离心5 min，收集并合并滤液后浓缩，经真空冷冻干燥后得到醇提物.

供试液的制备：称取样品醇提物及阳性对照(VC)0.1 g，配制成0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的6个测试品溶液.

1.4.2 试验方法 DPPH自由基清除试验：分别量取2 mL不同浓度的样品溶液，加入0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，密封混匀，于25℃恒温避光反应30 min，测定λ=517 nm处测定吸光度Ai；以等体积乙醇溶液代替DPPH溶液为对照组测定吸光度Aj；以等体积超纯水代替样品溶液为空白组，同等条件测定吸光度Ao[14-15].DPPH自由基的清除率S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.

ABTS自由基清除试验：将7.00 mmoL/L的ABTS溶液和2.45 mmoL/L的过硫酸钾溶液等体积比混合，4℃避光静置12～14 h，即得ABTS自由基反应底物储备液.以pH 7.4，10 mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释储备液，直至λ=734 nm处ABTS自由基溶液的吸光度A=0.700±0.02.分别量取0.3 mL不同质量浓度的样品溶液后加入ABTS自由基溶液1.5 mL，密封混匀，室温避光反应6 min，在λ=734 nm处测定吸光度Ai；以等体积超纯水代替ABTS自由基溶液为对照组测定吸光度Aj；以等体积超纯水代替样品溶液为空白组测定吸光度A0[16].ABTS自由基的清除率S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.

总抗氧化能力测定试验：采用总抗氧化能力试剂盒，将FeSO4标准品溶液配置成6个浓度梯度，加入反应试剂，在λ=593 nm处测定标准品吸光度，得到线性回归方程为：y=11.276x-0.016 1，其中y为吸光度值；x为Fe2+的浓度(μmol/mL)，R2=0.992.此后根据试剂盒测定各样品的吸光度值y，根据回归方程求得x.根据公式：总抗氧化能力(μmol/mL)=x×V反总÷V样=34x，求得样品相应的总抗氧化能力.

2 结果与分析

2.1 不同产地荒漠肉苁蓉的苯乙醇苷成分分析

2.1.1 荒漠肉苁蓉的7种苯乙醇苷成分分析 通过高效液相色谱分析技术，得到了不同产地样品和标准品的液相谱图如图1所示，同时测定了不同产地荒漠肉苁蓉样品中的7种苯乙醇苷成分，其含量测定结果见表2.3个产地的荒漠肉苁蓉样品中7种苯乙醇苷成分均有检出.根据《中华人民共和国药典》的规定，肉苁蓉药材指标成分松果菊苷(C35H46O20)和毛蕊花糖苷(C29H36O15)的总量应不低于0.30%[2]，本研究所测荒漠肉苁蓉样品均达到该规定.

为明确不同产地样品的差异性，对不同产地样品苯乙醇苷含量进行方差分析，发现新疆产地与内蒙古产地样品中7种苯乙醇苷总含量无显著性差异(P>0.05)，但内蒙古产地样品总含量显著高于哈萨克斯坦产地样品(P<0.05).内蒙古产地样品中指标成分松果菊苷和毛蕊花糖苷含量均显著高于新疆和哈萨克斯坦产地(P<0.05)，新疆和哈萨克斯坦产地荒漠肉苁蓉中松果菊苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷为其主要苯乙醇苷成分.样品含有的化学成分与活性物质会受到所处地区的气候、降水、土壤、日照和寄主等环境条件的影响，内蒙古因独特的自然条件使得荒漠肉苁蓉样品累积了大量的活性物质，使其成为道地性产地，其品质和疗效也优于其他产地.

HX、HM、HH和SD分别表示新疆、内蒙古、哈萨克斯坦产地样品和标准品；1号峰：松果菊苷；2号峰：肉苁蓉苷A；3号峰：管花苷A；4号峰：毛蕊花糖苷；5号峰：异毛蕊花糖苷；6号峰：2′-乙酰毛蕊花糖苷；7号峰：管花苷B.HX,HM,HH and SD denote samples from Xinjiang,Inner Mongolia,Kazakhstan and standard samples;Peak No.1：Echinacoside;peak No.2：Cistanchein A;Peak No.3：Tubularin A;Peak No.4：Yerbascum glycoside;Peak No.5：Isocurrantin Glycosides;Peak 6：2′-acetyl verbascoside；Peak 7：Tubalin B.图1 不同产地荒漠肉苁蓉和标准样品的液相谱图Figure 1 HPLC of C.Deserticola from different producing areas and standard samples

表2 不同产地样品7种苯乙醇苷成分的含量

2.1.2 不同产地荒漠肉苁蓉的主成分分析 采用SPSS 26软件对荒漠肉苁蓉进行主成分分析，将不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷含量经标准化处理后，计算方差贡献率，见表3.共提取到3个主成分，累积贡献率达83.824%，能较好地代表荒漠肉苁蓉大部分成分信息.其主成分得分图如图2所示，不同产地荒漠肉苁蓉可分为3类：新疆产地样品分为一类，主要集中在中部位置；内蒙古产地分为一类，主要集中在右上部；哈萨克斯坦样品分为一类，主要集中在左下部.主成分分析能够将不同产地样品有效地进行区分，说明不同产地荒漠肉苁蓉之间存在明显差异.

表3 特征值和方差贡献率

2.2 不同产地荒漠肉苁蓉醇提物体外抗氧化活性分析

2.2.1 不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对DPPH自由基的清除结果 不同产地荒漠肉苁蓉样品醇提物对DPPH自由基的清除结果如图3所示.以VC(抗坏血酸)为阳性对照，在质量浓度为0.025～0.6 mg/mL范围内，不同产地样品对DPPH的清除率随着样品浓度的增大而增大后趋于平行.在浓度为0.6 mg/mL时，样品清除率呈现平行趋势，说明DPPH单电子配对与醇提物中的自由基清除剂的数量已达到饱和，样品对DPPH自由基的清除率已达到最大值，且均大于85%，表明不同产地荒漠肉苁蓉对DPPH自由基均具有良好的清除效果.不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对DPPH自由基的半数抑制质量浓度IC50从大到小排序：哈萨克斯坦样品(0.151 mg/mL)>新疆样品(0.092 mg/mL)>内蒙古样品(0.090 mg/mL)>VC(0.003 mg/mL).新疆与内蒙古产地样品对DPPH自由基清除能力的IC50无显著差异(P>0.05).即不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对DPPH自由基的清除能力从大到小排列为：内蒙古样品≈新疆样品>哈萨克斯坦样品.

HX、HM、HH和SD分别表示新疆、内蒙古、哈萨克斯坦产地样品.HX,HM,HH and SD denote samples from Xinjiang,Inner Mongolia,Kazakhstan.图2 主成分分析图Figure 2 Principal component analysis score chart

HX、HM、HH和VC分别表示新疆、内蒙古、哈萨克斯坦产地样品和维生素C对照品.HX,HM,HH and VC denote the samples from Xinjiang,Inner Mongolia and Kazakhstan and the vitamin C reference substance.图3 不同产地样品醇提物对DPPH自由基的清除效果Figure 3 Scavenging effects of alcohol extracts from different areas samples on DPPH free radicals

2.2.2 不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对ABTS自由基的清除结果 不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对ABTS自由基的清除结果如图4所示.不同产地荒漠肉苁蓉醇提物在质量浓度为0.025～0.6 mg/mL时，清除率随着样品质量浓度的增大而不断增大，呈现量效关系.在质量浓度为0.6 mg/mL，不同产地样品醇提物对ABTS自由基清除率均大于94%，表明不同产地荒漠肉苁蓉醇提物均对ABTS自由基具有很好的清除效果.不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对ABTS自由基的半数抑制质量浓度IC50从大到小排序为：哈萨克斯坦样品(0.169 mg/mL)>新疆样品(0.154 mg/mL)>内蒙古样品(0.136 mg/mL)>VC(0.010 mg/mL).即不同产地荒漠肉苁蓉醇提物对ABTS自由基的清除能力从大到小排列为：内蒙古样品>新疆样品>哈萨克斯坦样品.

2.2.3 不同产地荒漠肉苁蓉醇提物的总抗氧化能力 不同产地荒漠肉苁蓉醇提物的总抗氧化能力如图5所示.不同产地荒漠肉苁蓉醇提物均具有总抗氧化能力，在质量浓度为0.025～0.6 mg/mL范围，总抗氧化能力随着样品浓度的增大而不断增大.不同产地荒漠肉苁蓉醇提物的总抗氧化能力的半数抑制质量浓度IC50分别为新疆(1.692 μmol/mL)>哈萨克斯坦(0.308 μmol/mL)>内蒙古(0.302 μmol/mL)>VC(0.098 μmol/mL).内蒙古与哈萨克斯坦产地样品总抗氧化能力IC50无显著差异(P>0.05)，但与新疆产地样品差异显著(P<0.05).表明不同产地荒漠肉苁蓉醇提物的总抗氧化能力从大到小排列为：内蒙古样品≈哈萨克斯坦样品>新疆样品.

HX、HM、HH和VC分别表示新疆、内蒙古、哈萨克斯坦产地样品和维生素C对照品.HX,HM,HH and VC denote the samples from Xinjiang,Inner Mongolia,and Kazakhstan and the vitamin C reference substance.图4 不同产地样品醇提物对ABTS自由基的清除效果Figure 4 Scavenging effects of alcohol extracts from different areas samples on ABTS free radicals

2.2.4 荒漠肉苁蓉抗氧化活性综合评价 由上分析可知，不同产地荒漠肉苁蓉在不同指标条件下抗氧化能力有所区别，故本研究以DPPH、ABTS和总抗氧化能力3种抗氧化能力的IC50为指标，进行多元指标的TOPSIS综合评价(表4).综合评价结果表明，不同产地荒漠肉苁蓉的综合抗氧化能力由强到弱依次排序为：内蒙古样品>哈萨克斯坦样品>新疆样品.研究表明苯乙醇苷成分具有良好的药理活性特征[17]，内蒙古荒漠肉苁蓉的抗氧化能力最强可能与苯乙醇苷成分的含量最高有关系.杨建华等[18]通过对肉苁蓉属植物中6种苯乙醇苷类化合物的抗氧化活性进行研究，发现2′-乙酰基毛蕊花糖苷对DPPH自由基的清除能力最强，哈萨克斯坦样品醇提物的抗氧化能力可能与高含量的2′-乙酰基毛蕊花糖苷有关.

HX、HM、HH和VC分别表示新疆、内蒙古、哈萨克斯坦产地样品和维生素C对照品.HX,HM,HH and VC denote the samples from Xinjiang,Inner Mongolia and Kazakhstan and the vitamin C reference substance.图5 不同产地样品醇提物的总抗氧化能力Figure 5 Total antioxidant capacity of alcohol extracts from different areas samples

表4 荒漠肉苁蓉多元指标TOPSIS评价结果

3 讨论

为研究药材的道地性，赵志红等[19]通过对内蒙古、新疆和宁夏3个产区荒漠肉苁蓉进行品质特征研究发现，不同产地荒漠肉苁蓉药效成分含量存在明显差异，松果菊苷和毛蕊花糖苷以内蒙古产地最高；周晔等[20]通过HPLC-ESI-MS和FTIR方法发现蒙古国和新疆产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷成分存在明显差异.本文对新疆、内蒙古和哈萨克斯坦产地的荒漠肉苁蓉进行主成分分析，发现不同产地样品中主要的苯乙醇苷成分含量具有明显差异，内蒙古荒漠肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量最高.荒漠肉苁蓉的质量受到自身的遗传特性、环境条件(温度、水分、土壤等生态因素)及人为因素(播种、加工、采收、炮制和运输等)等影响，而内蒙古因其特殊的自然条件使其主要活性成分含量高于其他产地，成为荒漠肉苁蓉的道地性产地.且在收集过程中发现，内蒙古产地荒漠肉苁蓉较其他产地样品具有油亮、质地软、难烘干等特点，符合“油亮、体重、肥厚、质柔润、味甘”的道地性品质特征[19].新疆产地荒漠肉苁蓉的苯乙醇苷总含量也很高，表明新疆产地荒漠肉苁蓉也具有很好的药用价值.

人体内95%以上的自由基都是氧自由基，这些自由基可严重损害人体的细胞、组织，进而引起慢性疾病及衰老效应，适量的补充抗氧化食品是清除人体自由基、增强抗氧化防御系统、延缓衰老、预防疾病的最佳保健方法[21-24].体外抗氧化实验研究发现，不同产地荒漠肉苁蓉醇提物均具有良好的抗氧化效果，对DPPH自由基清除率均达85%以上，对ABTS自由基清除率均达94%以上.通过TOPSIS法对不同产地荒漠肉苁蓉的抗氧化能力进行综合评价，发现内蒙古产地的肉苁蓉抗氧化活性最强.本文推测醇提物的抗氧化活性与苯乙醇苷的含量有一定关系，苯乙醇苷含量较高的样品其抗氧化能力越强.有学者指出苯乙醇苷的抗氧化能力与苷元及苯丙烯酰基上的酚羟基数目、酚羟基连接位置、化合物空间位阻的大小等多种因素相关[16].哈萨克斯坦产地荒漠肉苁蓉也具有很强的综合抗氧化能力，通过化学成分分析可知，2′-乙酰基毛蕊花糖苷为哈萨克斯坦产地样品中含量最高的苯乙醇苷化学成分，故推测哈萨克斯坦产地样品的综合抗氧化活性可能与2′-乙酰基毛蕊花糖苷含量有关.本研究通过对不同产地荒漠肉苁蓉的苯乙醇苷成分及抗氧化活性进行对比分析，为荒漠肉苁蓉药用资源的综合开发与医药保健行业的应用提供基础依据.

4 结论

不同产地荒漠肉苁蓉7种苯乙醇苷成分在含量上存在明显差异，内蒙古产地样品中苯乙醇苷成分以松果菊苷和毛蕊花糖苷为主，而新疆与哈萨克斯坦产地样品中苯乙醇苷成分以松果菊苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷为主.不同产地样品醇提物均具有良好的抗氧化活性，其综合抗氧化能力由强到弱依次排序：内蒙古样品>哈萨克斯坦样品>新疆样品.主成分分析可用于荒漠肉苁蓉产地鉴别研究中.