油菜素内酯对低温胁迫下番茄幼苗生理指标的影响

王光正，吕剑，毛娟，陈佰鸿，冯致，马宗桓

(甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 730070)

番茄(SolanumlycopersicumL.)原产于南美洲西部的秘鲁、智利、玻利维亚及厄瓜多尔等国家的高原或谷地,是茄科(Solanaceae)番茄属(LycopersiconMiller)中以成熟多汁浆果为食用器官的草本植物[1].番茄是维生素的重要来源，也是小农和中等规模商业农民大量种植的经济作物.许多研究表明，番茄在农艺条件允许的任何地方都是以商业化的数量种植的[2]，但在中国北方露地和设施早春栽培中，易受到低温冷害，造成番茄生产受到严重影响.冷害会造成植株苗弱、生长迟缓、萎蔫、黄化、局部坏死、坐果率低、产量降低和品质下降等不良影响[3].而在番茄幼苗期，低温胁迫对植株影响尤为严重，番茄属于冷敏感性强的作物，温度低于10 ℃时生长发育受阻，气温为8 ℃时，生长量增加迟缓，5 ℃时生长完全停止，生产上常因低温的影响而使其生育期受阻[4].即使短期低温，植株生长也会受到抑制.近些年在日光温室的发展过程中，由于冬春季气候变化和设施覆盖材料保温性、透光性能的局限性，易引起温室内低温弱光等不良环境条件，限制了设施番茄的生产，使得冬春茬番茄的冷害问题变得日益突出.众多研究表明，低温胁迫导致番茄生理代谢受到显著抑制，如光合作用降低、抗氧化酶活性下降、叶绿素降解、生长发育受阻等.因而，研究提高设施番茄在低温胁迫下的适应性显得尤为重要[5-6].

前人研究中，发现许多类型的激素可以提高番茄的低温适应性，例如褪黑素预处理可以通过降低番茄叶片氧化胁迫提高光合碳同化能力、提高番茄叶片的抗氧化能力、增加蔗糖、脯氨酸和多胺的积累来显著缓解番茄低温胁迫[7].油菜素内酯(BR)是一种新型植物激素，在植物体内含量极低，但生理活性却极高，植物经极低浓度BR处理后便能表现出明显的生理效应[8-10]，BR和褪黑素效果类似，能减轻不同抗冷性的植物幼苗在低温胁迫中的伤害作用，研究发现BR对低温胁迫下番茄幼苗的光合机制有积极的影响[11]，而且BR能促进幼苗根系和基叶的正常生长和健壮度，其作用方式是通过阻止植物幼苗产生过多的自由基或诱导形成较多的自由基清除剂，例如抗氧化酶可以减轻膜脂过氧化作用，从而稳定膜的结构与功能，增强膜的防卫能力，以适应低温逆境的变化[12-13].但BR是否对番茄在低温胁迫下生长有缓解的研究并不多见，本研究通过测定BR处理的番茄幼苗在不同时段低温逆境下的生理指标，来探究BR在番茄幼苗应对低温胁迫中的作用，旨在为番茄抗逆育种和品质改良提供理论基础和技术支持，同时也能对BR在番茄生产中的应用具有一定的指导意义.

脱落酸(Abscisic acid,ABA)是一种以异戊二烯为基本单位的倍半萜羧酸，早在上世纪六十年代就被科学家发现，被认为是五大类植物激素之一[14]，具有促进脱落、促进休眠、抑制生长、提高抗逆性的作用.但是不同浓度的脱落酸对园艺作物有不同的影响，如在茄子幼苗的低温胁迫中，10 mmol/L的ABA可以有效缓解茄子幼苗的低温胁迫，而40 mmol/L的ABA缓解效果不明显[15]，另外在低温胁迫对豇豆幼苗生理生态影响的研究中也同样发现低浓度(10 mmol/L)的ABA缓解效果最好，高浓度(40 mmol/L)的ABA缓解效果不显著[16].而BR作为抗逆境胁迫植物激素的新秀，可以通过与ABA互作参与调控植物的多种抗逆过程，但不同逆境所涉及的分子调控机制不同，因此BR和ABA的关系既有拮抗，又有协同，取决于所响应的逆境种类.例如盐胁迫条件下，BR拮抗ABA的耐盐效应；而在干旱和氧化胁迫条件下，BR与ABA共同提高植物的抗性等[17].但是ABA是否会对BR的抗低温效果有抑制作用的研究也不多见.本试验对低温胁迫下的番茄幼苗分别喷施BR及其抑制剂ABA，以明确BR在不同时段缓解低温胁迫的生理基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为番茄，品种为卡焰.番茄种子在60 ℃温水浸种后用纱布包裹置于培养皿中，将培养皿转移至气候箱中进行催芽，温度设置为恒温25 ℃，光照为0.发芽后在玻璃温室中定植，基质为草炭∶珍珠岩∶蛭石∶甘肃农业大学园艺学院自制营养基质= 9∶3∶3∶1，每盆一株.育苗至两片真叶期，期间每天浇水、每隔4 d喷施一次1 000倍的吡虫啉以防白粉虱，两片真叶后移植到10 cm×10 cm小花盆中.

1.2 试验设计

在番茄四叶期，挑选长势一致的番茄植株(株高在15 cm左右)随机分成3组，每组为一个处理，每个处理45株，每15株为一个重复.然后将3个处理组植株都转移至气候箱中，条件设置为光周期为16 h光照、8 h黑暗，温度为光照时10 ℃，黑暗条件下4 ℃，光照强度为4 000 lx，相对湿度为60%.3个处理分别为T1：喷洒去离子水；T2：喷洒0.5 μmol/L油菜素内酯溶液；T3：喷洒0.5 μmol/L油菜素内酯溶液和50 mmol/L脱落酸溶液；对照为T1.所有处理于每天上午9∶00喷洒一次相应溶液，连续处理3 d，每次喷至叶面有水滴滴落为止.在开始处理后的0、24、48、72 h取样测定丙二醛含量、电导率、光合指标、抗氧化酶活性、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性.

1.3 测定方法

1.3.1 光合生理指标的测定 利用LI-6400便携式光合测定分析仪于晴天早上9∶00～11∶00测定光合生理学参数，测定时用开放式气路，大气CO2浓度基本在340～380 μmol/mol，控制温度25 ℃,相对湿度60%，PAR控制在1 000 μmol/(m·s)，测定叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci).

1.3.2 生理指标的测定 电解质渗透率和MDA含量测定参照文献[7]并稍作修改，SOD酶活性测定用氮蓝四唑法[18]，POD酶活性测定采用愈创木酚法[19]，CAT酶活性测定采用分光光度法[20].SS酶、SPS酶均采用(分光光度法)试剂盒进行测定(苏州科铭生物有限公司).

1.4 数据统计与分析

数据采用Excel 2010软件进行处理和图表绘制，后用SPSS软件进行Duncan多重比较分析.

2 结果与分析

2.1 油菜素内酯对番茄MDA和电解质渗透率的影响

油菜素内酯显著抑制了番茄幼苗体内的MDA含量，如图1-A所示，胁迫72 h后，T2处理番茄的MDA含量仅为6.406 μmol/g而T1处理番茄的MDA含量是T2的3倍，达到19.261 μmol/g.T3处理番茄的MDA含量是T2的1.6倍，为10.50 μmol/g，T2处理番茄的MDA含量显著低于T1和T3.

T1：低温；T2：低温+BR；T3：低温+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.图1 油菜素内酯及脱落酸对番茄叶片MDA含量以及电解质渗透率的影响Figure 1 Chilling effect on malonaldehyde (MDA) content (A) and electrolyte leakage (B) in leaves of seedlings of tomato in different periods by BR and ABA

图1-B显示低温胁迫下电解质渗透率随着胁迫时间的增加而增加，但油菜素内酯显著抑制了番茄幼苗体内电导率的上升.胁迫72 h后，T2处理番茄的电导率为63%，而T1处理番茄的电解质渗透率为93%，是T2的1.5倍.T3处理番茄的电解质渗透率为80.6%，是T2的1.3倍，均显著高于T2.

2.2 油菜素内酯对番茄光合系统的影响

油菜素内酯显著缓解了低温胁迫后番茄幼苗体内Ci值的上升，胁迫72 h后，T1处理番茄的Ci是T2的1.3倍，T3是T2的1.2倍，T2处理番茄的Ci仅为564 μmol/mol，显著小于T1和T3(图2-A).

由图2-B可以看出，胁迫24 h后，T2处理番茄的Pn为9.1 μmmol/(m·s)，是T1的4倍，是T3的1倍，差异显著，并且在胁迫的72 h中，T2处理番茄的下降速度明显慢于T1，说明BR可以对保护番茄幼苗在低温胁迫下的光合速率有一定作用.

对于气孔导度，胁迫24 h后T2处理番茄的Gs为222 mmol/(m·s)，是T1、T3的1.3倍和1.2倍，胁迫48 h后T2的Gs下降到170 mmol/(m·s)，但仍然高于T1、T3，分别是T1、T3的1.5和1.3倍(图2-C).

T1：低温； T2：低温+BR； T3：低温+BR+ABA.T1：Cold； T2：Cold+BR； T3：Cold+BR+ABA.图2 油菜素内酯及脱落酸对番茄叶片光合系统的影响Figure 2 Photosynthetic traits as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

2.3 油菜素内酯对番茄抗氧化酶活性的影响

24 h低温胁迫后T2处理番茄的CAT活性为4.67 U/g，是T1、T3的1.6倍，胁迫48 h后达到6.93 U/g，是T1、T3的1.5倍.胁迫72 h后T2比T1和T3高了2.5倍、2.0倍(图3-A)，达到12.68 U/g.3个时段T2处理番茄的CAT活性均显著高于T1和T3.

T2处理番茄的POD活性在低温胁迫48 h后达到19.52 U/g，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍.在低温胁迫72 h后升高到21.82 U/g，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍，两个时段下T2处理番茄的POD活性均显著高于T1、T3(图3-B)

低温胁迫72 h后，T2处理番茄的SOD 活性为21.41 U/g，T1为11.71 U/g，T3为12.57 U/g，此时T2是T1的1.8倍，是T3的1.7倍，SOD活性均显著高于T1和T3(图3-C).

2.4 油菜素内酯对番茄植株内蔗糖代谢相关酶的影响

从图4-A中可以看到，在3个处理中T1、T3两组番茄的SPS增长处理番茄极其微小，胁迫48 h后两组分别增长了59.02 μg/(min·g)、40.67 μg/(min·g)，但是T2处理番茄的SPS增长显著，48 h后增加了244.75 μg/(min·g).在低温胁迫48 h时，T2处理番茄的SPS活性是T1、T3的SPS活性的1.6倍,即使在72 h时T2的SPS活性有所下降，也比其他两个处理组高1.5倍，差异仍然显著.

T1：低温；T2：低温+BR； T3：低温+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.图3 油菜素内酯及抑制剂对番茄幼苗抗氧化酶活性的影响Figure 3 Changes in activities of antioxidant enzymes as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

低温胁迫48 h时，T2处理番茄的SS为521.12 μg/(min·g)，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍，在低温胁迫72 h时T2处理番茄的SS为493.39 μg/(min·g)，比其余两个处理高1.4倍(图4-B)，均达到显著差异.

T1：低温；T2：低温+BR；T3：低温+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.图4 低温胁迫下油菜素内酯及抑脱落酸对番茄幼苗蔗糖代谢相关酶活性的影响Figure 4 Changes in activities of sucrose metabolism-related enzymes as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

3 讨论与结论

低温胁迫下植物体内首先受到损害的是细胞膜系统.而MDA 含量和电解质渗透率是用于表示细胞膜受损害程度的两个重要指标，有研究发现，外源BR能有效地缓解低温胁迫对华山松幼苗的影响，降低活性氧对其幼苗的伤害，减轻膜脂过氧化程度，提高华山松幼苗的抗寒能力，还有研究发现BR可以有效抑制低温胁迫下竹笋的MDA和电解质的泄露[21-22].本试验中，低温胁迫处理的番茄幼苗叶片中的 MDA含量和电导率迅速增加，但BR处理的番茄幼苗MDA含量和电导率在72 h时显著优于低温胁迫处理的幼苗，表明细胞膜系统在低温胁迫下会受到严重的氧化损伤，而BR处理则有效缓解了细胞膜的损伤从而保护番茄幼苗体内膜系统.

在羊草和油桐的低温胁迫研究中也发现BR能够减小低温胁迫对细胞膜的毒害作用同时降低电解质渗透率，从而提高这两种植物的抗寒性，同时发现MDA 含量和电解质渗透率的降低可能是由于番茄幼苗叶片中的抗氧化物酶活性增高引起的[23-24].许多研究表明BR的确能够提高一些植物在胁迫环境下体内抗氧化酶的活性[25-26]，比如在辣椒幼苗的抗低温胁迫研究中发现低温对辣椒幼苗体内的抗氧化酶有显著影响，而外源EBR处理可调节辣椒根系形态和提高根系抗氧化酶活性，增强植株抗低温胁迫的能力[27-28].在野生垂穗披碱草幼苗的抗低温研究中发现，施用BR后抗氧化酶基因的表达量均得到上调，说明了BR对低温具有有效的缓解作用[29].本试验中经BR处理的低温胁迫环境下的番茄幼苗在72 h时SOD、CAT、POD的活性都比不施用BR的番茄幼苗高(图3)，这说明BR处理对于提高番茄幼苗在逆境胁迫下的抗氧化能力以保护膜系统从而维持番茄幼苗生理代谢系统的正常运转具有明显效果.

在BR对低温胁迫下黄瓜幼苗光和系统影响的研究中发现，BR可以有效缓解黄瓜在低温胁迫下的光合作用[30]，而在上述羊草和油桐的研究中也证实了BR对植物光合系统的缓解作用和可溶性糖生成的促进作用.而本试验中，BR处理的番茄幼苗Pn、Ci、Gs三项生理指标均显著优于对照，说明BR处理也可以缓解因低温胁迫对番茄幼苗光合系统运转的不利影响，保证光合作用的正常进行.番茄幼苗经48 h的胁迫后，BR处理的番茄幼苗SPS活性和SS活性是对照的1.67倍，说明了BR对低温胁迫下番茄幼苗体内蔗糖的生成有一定促进作用，在一定程度上可以帮助番茄幼苗维持体内的可溶性糖含量以维持渗透平衡从而保护幼苗的生理代谢.

脱落酸(ABA)是一种植物生长调节剂，它能促进叶片衰老，加快植株代谢.拟南芥基因芯片结果显示BR和ABA协同调控超过200个共同的目标基因，还有研究发现BR处理拟南芥和油菜种子可提高植株对干旱和低温胁迫的耐受性，该过程涉及对ABA合成及多个胁迫相关基因(RD29A、ERD10和RD22)表达的诱导[17].在本试验中，BR和ABA同时处理的番茄幼苗在胁迫72 h后其电导率是经BR处理幼苗的1.28倍、MDA含量是BR处理的1.64倍、Pn是BR处理的2.26倍；在抗氧化物酶活性上，只经BR处理的幼苗比BR、ABA共处理的幼苗高1倍以上；胁迫48 h后，只经BR处理的幼苗的SPS活性和SS活性是BR、ABA共处理的1.3倍.这些数据表明若在番茄幼苗的抗低温胁迫中ABA和BR同时施用，那么ABA会对BR的低温缓解效果产生抑制作用.

综上所述，BR处理的番茄幼苗在低温逆境下的各项生理指标均优于对照，并在72 h时保护番茄幼苗膜系统完整性的效果最显著，在48 h时对番茄幼苗体内蔗糖转化的促进效果最显著，表明BR在保护膜系统、提高幼苗抗氧化能力、保护光合系统、维持渗透平衡方面有着十分显著的效果.意味着BR对于低温逆境下番茄幼苗的生长有一定的促进和保护作用，可以提高番茄幼苗对低温胁迫下的抗性.而ABA对BR具有抑制作用，二者同时施用不会提高番茄幼苗的抗冷性.