5种药剂对大豆孢囊线虫孵化及2龄幼虫室内毒力的影响

姜伟，张海英，李金鸿，连芸芸，吴锦 ，刘永刚 ，李惠霞

(1.甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃省无公害农药工程实验室，甘肃 兰州 730070)

大豆孢囊线虫病(soybean cyst nematode，SCN)是由大豆孢囊线虫(HeteroderaglycinesIchinohe)引起的植物内寄生性线虫病害，具有分布广、寄主范围宽、孢囊存活时间长及危害严重等特点[1].该线虫病害在世界各国大豆主产区均有发生，每年可造成高达30亿美元的经济损失[2].在我国，黑龙江、内蒙古、北京、江苏、安徽、山西、山东、甘肃等20多个省相继报道了该病害的发生和危害[3-4]，在东北和黄淮海大豆产区发生尤为严重，一般可造成30%以上减产，严重地块甚至绝收[5].甘肃省大豆年播种面积约为11.5万hm2，产区主要分布在陇东南.罗宁等[6]调查发现，甘肃省大豆孢囊线虫发生比较普遍，主产区孢囊检出率为63.7%～87.2%，且线虫基数较高，平均孢囊数为1.2～11.4个/100 g土，对甘肃省大豆产业健康发展造成了严重威胁.

植物寄生线虫，尤其是孢囊线虫具有很强的繁殖能力与环境适应性，而生产中对于孢囊线虫的防治主要以抗病育种为主，在缺乏有效抗源材料的背景下，化学药剂仍然是目前防治大豆孢囊线虫的重要手段.传统的广谱性杀线剂如涕灭威、克百威、灭线磷和甲基异柳磷等因为高毒、高残留，造成严重的“3R”问题，已被禁用或限用[7-8].当前市场上非常缺乏防治大豆孢囊线虫的专用杀线剂.因此，研制和筛选高效、安全、低毒的杀线剂防控大豆孢囊线虫，显得尤为迫切.二硫氰基甲烷是一种具有强烈杀菌杀线虫活性的有机硫氰化合物，对多种病原真菌、细菌具有很好的生物学活性，但对于其杀线活性研究较少.本研究以大豆孢囊线虫为试验材料，测定了二硫氰基甲烷和4种常用药剂对孵化、2龄幼虫的毒力、运动行为和形态的影响，以期为新型杀线剂的开发和利用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试虫源 供试线虫采自甘肃省平凉市泾川县大豆孢囊线虫发生较严重地块.将采集的病土带回实验室，采用漂浮法分离孢囊，并在体视显微镜下挑取饱满的新鲜孢囊，于4 ℃保存备用.

1.1.2 供试药剂 1.8%阿维菌素乳油，河北全德伦生化科技有限公司生产；20%噻虫胺悬浮剂，江苏辉丰生物农业股份有限公司生产；20%噻唑膦水乳剂，山东大农药业有限公司生产；40%辛硫磷乳油，山东埃森化学有限公司生产；98%二硫氰基甲烷原药，甘肃省农业科学院植物保护研究所提供.

1.2 试验方法

1.2.1 大豆孢囊线虫2龄幼虫悬浮液制备 2龄幼虫悬浮液制备：将消毒的孢囊置于灭菌的孵化池中孵化，以灭菌水为孵化液，使水稍漫过孢囊为宜.在25 ℃培养箱黑暗条件下进行孵化，4 d后开始收集2龄幼虫，根据试验需要调整2龄幼虫悬浮液浓度.

1.2.2 药剂配制方法 将98%二硫氰基甲烷原药溶于甲醇，1.8%阿维菌素乳油、20%噻虫胺悬浮剂、20%噻唑膦水乳剂、40%辛硫磷乳油4种药剂溶于无菌水，然后均配制成10 000 mg/L的母液，测定时用无菌水稀释至所需系列浓度.各药剂质量浓度设置依据试验前期药剂质量浓度筛选及推荐剂量.

1.2.3 5种药剂处理对大豆孢囊线虫孵化的影响 将新鲜饱满的孢囊消毒后，置于6孔细胞培养板中进行药液浸渍处理(每孔10个孢囊)，每孔药液吸入1.5 mL，重复3次，以无菌水作为对照，并每天更换新的药液，置于25 ℃培养箱中进行孵化.每3 d检查1次，记录2龄幼虫数量；7 d后用无菌水清洗3～5次，将药液更换为无菌水，每隔3 d在显微镜下观察2龄幼虫的孵化情况，统计数量，并更换新鲜孵化液.30 d后统计处理2龄幼虫孵化数量，计算孵化抑制率.

1.2.4 5种药剂对2龄幼虫的毒力 在6孔细胞培养板中药液浸渍处理线虫，每孔加入1 mL大豆孢囊线虫2龄幼虫悬浮液(约100条)，然后加入1 mL不同质量浓度的药液.以无菌水作为对照，每质量浓度重复3次，于25 ℃培养箱中进行培养.处理后24 h、48 h在体视显微镜下统计线虫存活情况，计算死亡率和校正死亡率，并计算各药剂的LC50和LC90.

1.2.5 二硫氰基甲烷与阿维菌素对2龄幼虫运动行为的影响 根据毒力测定试验结果，吸取5 mg/L二硫氰基甲烷与阿维菌素药液各1 mL，将新鲜活跃的50条二龄幼虫放入培养板中，分别处理1、6、12、24 h后，随机选择10条线虫在体视显微镜下观察1 min内线虫运动情况.试验以无菌水作为对照，每个处理进行3次重复.

运动行为测定参照Tsalik和Hobert的方法[9].线虫头部摆动频率：在1 min内，线虫头部从一侧摆向另一侧后再摆动回来；线虫身体弯曲频率：在1 min内，线虫的部分身体相对于身体长轴的改变次数.

1.2.6 二硫氰基甲烷与阿维菌素对2龄幼虫形态的影响 分别吸取5 mg/L二硫氰基甲烷与阿维菌素药液各1 mL于6孔细胞培养板中，加入50条线虫药液浸渍处理24 h后，各个处理随机挑取10条线虫置于载玻片上，热杀死后于显微镜下拍照并测量线虫体长、体宽、口针和尾部透明区长度.试验以无菌水作为对照，每个处理进行3次重复.

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 22.0进行数据统计处理及分析.

2 结果与分析

2.1 5种药剂处理对大豆孢囊线虫孵化的影响

不同质量浓度处理后，5种药剂均对大豆孢囊线虫的孵化表现出抑制作用.其中，二硫氰基甲烷对孢囊线虫的孵化抑制作用最强，且随着药剂质量浓度的增大，孵化抑制作用逐渐增强，在2.5～10 mg/L范围内，孵化抑制率显著高于其他药剂，孵化抑制率为81.15%～96.86%.其次是阿维菌素，在高浓度下对孢囊线虫的抑制率与二硫氰基甲烷相当.不同质量浓度噻唑膦对孵化的影响稍低，孵化抑制率为65.49%～79.58%.辛硫磷在低质量浓度下抑制作用较弱，但在高质量浓度下对孢囊内卵孵化的抑制作用与二硫氰基甲烷和阿维菌素无显著差异.

表1 5种药剂处理对大豆孢囊线虫孵化的影响

2.2 5种药剂对大豆孢囊线虫2龄幼虫的毒力

试验结果显示，不同药剂处理后，大豆孢囊线虫2龄幼虫死亡率显著高于对照，且随着处理时间及药剂质量浓度的增加，2龄幼虫的校正死亡率逐渐增大.其中2.5 mg/L二硫氰基甲烷药液作用于2龄幼虫48 h时，校正死亡率为64.26%.阿维菌素处理48 h时，2龄幼虫校正死亡率为68.16%.随着噻虫胺和噻唑膦处理时间延长，线虫校正死亡率呈直线上升，但二者差异不显著.辛硫磷处理48 h后，80 mg/L时的校正死亡率为48.97%，效果显著低于噻虫胺和噻唑膦(表2).

以供试药剂折百后的质量浓度为自变量，处理48 h线虫校正死亡率为因变量，建立农药毒力回归方程.结果表明，5种药剂对大豆孢囊线虫2龄幼虫的毒力差异较大，其中阿维菌素和二硫氰基甲烷对2龄幼虫表现出较强的杀线活性，显著高于噻虫胺、噻唑膦及辛硫磷.阿维菌素和二硫氰基甲烷的LC50值分别为1.072 7、1.135 5 mg/L，LC90值分别为15.638 7、11.662 7 mg/L(表3).

表2 5种药剂对大豆孢囊线虫2龄幼虫致死作用

2.3 二硫氰基甲烷与阿维菌素对2龄幼虫运动行为的影响

由图1～2可以看出，二硫氰基甲烷和阿维菌素均对2龄幼虫运动行为有显著的影响.随着处理时间的延长，身体弯曲与头部摆动频率呈下降趋势.与对照相比，5 mg/L的二硫氰基甲烷与阿维菌素处理12 h之后，2龄幼虫身体弯曲频率和头部摆动次数显著下降，表明二硫氰基甲烷和阿维菌素可影响2龄幼虫运动行为，从而影响其移动和寻找寄主的能力.

表3 5种药剂对大豆孢囊线虫2龄幼虫的毒力

图1 二硫氰基甲烷和阿维菌素对2龄幼虫身体弯曲频率的影响Figure 1 The effect of methylene bisthiocyanate and abamectin on the body bend frequency of the second-stage juveniles

2.4 二硫氰基甲烷与阿维菌素对2龄幼虫形态的影响

结果显示，二硫氰基甲烷与阿维菌素处理后，与对照相比，线虫部分形态测量值差异显著.表现为2种药剂处理后，线虫体长显著缩短，体宽显著变大，尾部透明区显著缩短，但口针无显著性差异.说明二硫氰基甲烷和阿维菌素处理后，线虫在形态上发生了改变.

图2 二硫氰基甲烷和阿维菌素对2龄幼虫头部摆动频率的影响Figure 2 The effect of methylene bisthiocyanate and abamectin on the head swing frequency of the second-stage juveniles

表4 二硫氰基甲烷和阿维菌素对2龄幼虫形态的影响

3 讨论

化学防治仍是当前防治大豆孢囊线虫病的重要手段.本试验测试了5种药剂对大豆孢囊线虫孵化及2龄幼虫的抑制作用，结果表明各药剂均对孵化有抑制作用，对2龄幼虫有致死作用，其中二硫氰基甲烷和阿维菌素对大豆孢囊线虫孵化的抑制作用显著，说明二硫氰基甲烷和阿维菌素较其他药剂更容易穿透孢囊壳与卵壳，这与李秀花等[10]小麦孢囊线虫的研究结果相似.

2龄幼虫是侵染寄主植物的主要虫态，低毒、高效的杀线剂能够抑制2龄幼虫，使其中毒死亡.本试验中，5种药剂对2龄幼虫毒力研究结果表明，二硫氰基甲烷和阿维菌素对2龄幼虫表现出强烈的杀线活性，其中5 μg/mL二硫氰基甲烷处理48 h时，2龄幼虫死亡率可达80%.祁之秋等[11-12]报道了二硫氰基甲烷对根结线虫2龄幼虫的LC50为0.72 mg/L，当5 μg/mL的药剂处理幼虫36 h，死亡率可达100%，其效果优于本试验，这可能与线虫种类不同有关.已有研究表明，二硫氰基甲烷作为种衣剂，对水稻干尖线虫和小麦孢囊线虫病的田间防效显著，且增产效果明显[13-14].本试验只测定了该药剂对大豆孢囊线虫的室内毒力，而田间防治效果还需进一步试验和研究.

运动行为是反应线虫神经系统基本功能的指标，已被广泛应用于一些重金属神经毒性的分析[15].本试验中，通过身体弯曲和头部摆动频率，观察二硫氰基甲烷和阿维菌素对2龄幼虫运动行为的影响，发现当暴露药剂处理24 h时，部分虫体虽未死亡，但与对照相比，线虫运动行为明显减缓.头部摆动与身体弯曲频率随药剂质量浓度的增加呈下降趋势，说明在药剂作用下，可能损害运动相关神经元，从而抑制了线虫的运动能力，对其移动和寻找寄主的能力也产生影响.与阿维菌素相比，二硫氰基甲烷处理后，线虫反应迟钝，运动功能受损严重，质量浓度越高，对线虫毒害作用越强.

线虫的体长、体宽等形态测量值的变化可直接反应其发育速度和生理状况，是衡量线虫发育情况的常用指标[16].本试验测试了二硫氰基甲烷和阿维菌素急性暴露条件下对大豆孢囊线虫形态测量值的变化，结果显示，和对照相比，药剂处理后的线虫体长显著减小，尾部透明区显著变短.说明2种药剂可使线虫形态发生改变.

本试验所选药剂中阿维菌素、噻唑膦已成功登记用于根结线虫的防治.阿维菌素作为一种神经毒剂抗生素类农药，除对根结线虫有较好的防治效果外，亦对孢囊线虫有作用.在本研究中，噻虫胺作为新烟碱类中的一种杀虫剂，对孢囊孵化和2龄幼虫毒杀均有一定影响，可与其他药剂复配使用来防控大豆孢囊线虫及其他地下害虫.噻唑膦对孢囊线虫杀线活性较低，这是否与线虫种类、药剂剂型及当地用药历史有关需要进一步研究.传统的杀虫剂辛硫磷虽然对孢囊线虫也有一定防效，但由于残留期太长，且防效易产生抗药性[17]，所以不推荐应用于孢囊线虫的防治.二硫氰基甲烷作为一种挥发性、具有强烈杀菌、杀线虫活性的有机硫氰化合物，长时间作用线虫后，能够使虫体溶解和死亡.研究表明，二硫氰基甲烷作为一种新型杀线剂，对南方根结线虫(MeloidogyneincongnitaChitwood)杀线活性强[18]，但目前对于该药剂防治孢囊线虫的研究还较少，对于其分解产物中的活性成分及作用机理有待后续深入研究.

4 结论

本试验所选药剂对大豆孢囊线虫孵化有抑制作用，对2龄幼虫有致死作用.其中二硫氰基甲烷作用效果最好，在质量浓度为5 mg/L时，孢囊内卵孵化抑制率达90.31%，显著高于其他药剂.毒力试验结果显示，10 mg/L的二硫氰基甲烷浸渍处理线虫48 h，校正死亡率为88.55%，LC50为1.135 5 mg/L，杀线活性强，且该药剂影响线虫活动行为，2龄幼虫形态发生了改变.因此，二硫氰基甲烷是一种具有防治作用的新型药剂，有望进一步开发利用.