HPLC法测定猪源纤维蛋白粘合剂中的枸橼酸离子含量

2021-09-22蒋玉辉梁蔚阳

中国医药科学 2021年23期

蒋玉辉梁蔚阳

[摘要]目的建立猪源纤维蛋白粘合剂中纤维蛋白原和凝血酶两种成分的枸橼酸离子含量测定的方法。方法采用高效液相色谱法，分析色谱柱为 Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为18 mmol/L 的磷酸二氢钠-0.1%异丙醇溶液（磷酸调节 pH 值至2.0），流速1 ml/min，柱温40℃，检测波长210 nm。采用标准曲线法进行分析。结果在该色谱条件下测得纤维蛋白原和凝血酶两种成分中枸橼酸离子的浓度线性范围分别为1～9 mmol/L（ r=0.999）、0.1～0.9 mmol/L（ r=0.999）。加样回收率分别为99.55%～102.63%（ n=18）、99.69%～101.61%（RSD=0.60%， n=12）。结论该方法操作简单，准确性高，专属性强，精密度、重复性、稳定性好，可用于测定猪源纤维蛋白粘合剂中的枸橼酸离子含量。

[关键词]猪源纤维蛋白粘合剂;纤维蛋白原;凝血酶;枸橼酸离子;高效液相色谱法

[中图分类号] R28 [文献标识码] A [文章编号]2095-0616（2021）23-0078-04

Determination of citrate ion in porcine fibrin adhesive by HPLC

JIANG Yuhui LIANG Weiyang

Guangdong Institute for Drug Control， Key Laboratory of Blood Products Quality Control of National Medical Products Administration， Guangdong， Guangzhou 510663， China

[Abstract] Objective To establish a method for determination of citrate ion content of fibrinogen and thrombin in porcine fibrin adhesive. Methods HPLC was used， the analytical column was Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm， 5μm）， the mobile phase was 18 mmol/L sodium dihydrogen phosphate -0.1% isopropanol solution （the pH value was adjusted to 2.0 by phosphoric acid）， the flow rate was 1 ml/min， the column temperature was 40℃ ， and the detection wavelength was 210 nm. The standard curve method was used for analyses. Results Under this chromatographic condition， the linear range of citrate concentration in fibrinogen and thrombin was 1-9 mmol/L （r=0.999） and 0.1-0.9 mmol/L （r=0.999）， respectively. The sample recovery rate was 99.55%-102.63%（n=18） and 99.69%-101.61%（RSD=0.60%， n=12）. Conclusion The method is simple， accurate， specific， precise， reproducible and stable， and can be used for the determination of citrate ion in porcine fibrin adhesive.

[Key words] Porcine fibrin adhesive; Fibrinogen; Thrombin; Citrate ion; High performance liquid chromatography

豬源纤维蛋白粘合剂是从健康猪血浆中分别分离、提纯猪纤维蛋白原和猪凝血酶，并经病毒去除和灭活处理、冻干制成。本品由猪纤维蛋白原及其稀释剂、猪凝血酶及其稀释剂4种成分组成，使用时将纤维蛋白原和凝血酶分别用稀释剂复溶后，同时喷于出血创面，发挥止血作用[1-2]。

猪源纤维蛋白粘合剂中含有的枸橼酸离子为枸橼酸钠，在猪血采集和生产工艺中引入，因其具有局部抗凝的作用[3-4]，会影响该药的止血功效，因此在该药品的质量标准中要控制其含量。枸橼酸离子的含量测定，国内外文献报道的方法有紫外-可见分光光度法[5-6]、酸碱滴定法[7]、离子色谱法[8-9]、全自动酶法[10]、高效液相色谱法[11-14]和离子交换-中和滴定法[15]等。本实验建立的 HPLC 法可以快速准确测定猪源纤维蛋白粘合剂中纤维蛋白原和凝血酶两种成分的枸橼酸离子含量，为猪源纤维蛋白粘合剂的质量控制提供依据。

1材料与方法

1.1仪器

高效液相色谱仪（2695/2487，美国 Waters 公司）;电子分析天平（CPA-225D，德国 Sartorius 公司）;真空恒温干燥箱（VOS-451SD，日本 EYELA 公司）;超纯水发生器（美国 Millipore 公司）。

1.2试药

枸橼酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号100396-201603，含量100.0%）;异丙醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。猪纤维蛋白原（A 公司，批号：20131220、20141021、20150605、20150708、20150810; B 公司，批号：F201501002、BC201501005、 BC201511006），猪凝血酶（A 公司，批号：20110704、20141007、20131213、20150606、20150708、20150811）。

1.3色谱条件

色谱柱为 WelchUltimateAQ-C18（4.6mm×250 mm，

5μm）;柱温：40℃;流动相：18.0 mmol/L 磷酸二氢钠-0.1%异丙醇溶液（磷酸调节 pH 至2.0）;流速1.0ml/min;紫外检测器波长210nm;进样量：20μl。1.4溶液的制备

1.4.1枸橼酸对照品储备液精密称取经105℃干燥2 h 的枸橼酸对照品（C6H8O7，分子量192.14，含量100.0%）1.92 g，用水溶解并定容至100 ml，摇匀得到100 mmol/L 的储备液。

1.4.2供试品溶液的制备各取样品1瓶，按标示量加水复溶后，精密量取1 ml，根据供试品的蛋白質浓度，加入适量1.5%磺基水杨酸溶液，混匀。室温静置2 h，3000 r/min 离心10 min，取上清液过滤，取续滤液即得。

1.5标准曲线的制备

精密量取“1.4.1”项下对照品储备液各适量，分别用水稀释成适当浓度的系列对照品溶液。纤维蛋白原的标准曲线浓度为1、3、5、7、9 mmol/L，凝血酶的标准曲线浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L。按“1.3”项下实验条件进样测定。以枸橼酸的摩尔浓度（x，mmol/L）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。

2结果

2.1典型色谱图及回归方程

对照品溶液和供试品溶液的典型色谱图见图1，枸橼酸峰出峰时间稳定，峰形良好，与相邻峰的分离度符合要求。回归方程与线性范围见表1。

2.2方法学验证结果

2.2.1定量限与检测限考察精密量取“1.4.1”项下对照品储备液适量，倍比稀释，并按“1.3”项下实验条件进样测定，当信噪比为10∶1时，得定量限，为0.5946 nmol;当信噪比为3∶1时，得检出限，为0.0991 nmol。

2.2.2精密度实验取猪纤维蛋白原（批号20131220）和猪凝血酶（批号20150811）样品，连续进样6次，枸橼酸峰面积的 RSD 分别为0.2%、0.5%，表明精密度良好。

2.2.3重复性实验取猪纤维蛋白原（批号20150605）和猪凝血酶（批号20141007）样品，按“1.4.2”项下分别制备6份供试品溶液，按“1.3”项下实验条件测定，根据各自的标准曲线计算含量。结果，纤维蛋白原和凝血酶6份供试品溶液中枸橼酸离子含量平均值分别为16.5、0.4 mmol/L， RSD 分别为0.9%、1.1%，表明本方法重复性良好。

2.2.4稳定性实验取猪纤维蛋白原（批号20141021）供试品溶液，室温放置0、37 h 时，进样测定，两次峰面积的相对偏差为0.32%;取猪凝血酶（批号20150811）供试品溶液，室温放置0、24 h 时，进样测定，两次峰面积的相对偏差为0.56%。表明纤维蛋白原和凝血酶供试品溶液室温放置24 h 内基本稳定。

2.2.5加样回收率实验取已知枸橼酸离子含量样品（猪纤维蛋白原批号20141021、F201501002，各9份;猪凝血酶批号20131213，12份），根据各自枸橼酸离子标准限度规定，分别加入一定量的枸橼酸对照品，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.3”项下实验条件测定，根据标准曲线计算加样回收率，见表2。

2.3样品枸橼酸离子含量测定

取猪纤维蛋白原样品8批、猪凝血酶样品6批，分别按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.3”项下实验条件进样测定，每批平行测定2份供试品溶液，根据标准曲线计算其中枸橼酸离子含量，见表3。

3讨论

猪源纤维蛋白粘合剂在临床上应用日益广泛，需控制其中的枸橼酸含量，以期获得更好的止血效果。现行质量标准均采用比色法，通过检测枸橼酸与吡啶、醋酐生成的紫红色溶液吸光度大小来反映枸橼酸离子含量[5]，其操作过程繁琐，而且需要用到吡啶、醋酸酐、三氟乙酸等有毒或刺激性试剂，对实验人员身体有害。因此，有必要建立新的方法测定猪源纤维蛋白粘合剂中的枸橼酸离子含量。本研究采用高效液相色谱法进行测定，实验结果令人满意。与现行标准的“比色法”相比较，高效液相色谱法的实验过程操作较为简便，不需要用到有毒试剂，而且准确性高，专属性强，重复性好。

枸橼酸为三元有机酸，在色谱柱中的保留较难洗脱。预实验时选用18.2 mmol/L 磷酸、磷酸二氢钠（pH 2.0）[16]-0.1%异丙醇溶液作为流动相，结果显示，枸橼酸峰与相邻色谱峰的分离度较差。于是调整流动相为18 mmol/L 的磷酸二氢钠-0.1%异丙醇溶液，再用磷酸调 pH 值至2.0，使用 C18水相柱，此时枸橼酸较快出峰，出峰的峰型好，塔板数高。虽然不同企业产品中的辅料不同，但由色谱图中可看出其他成分均可与枸橼酸峰达到基线分离，不干扰其测定。

枸橼酸为紫外末端吸收，选择210 nm 波长检测既能够减少溶剂及流动相干扰，又保证有足够响应值，进行定量检测。

由于国内2家企业生产的猪源纤维蛋白粘合剂中纤维蛋白原和凝血酶的枸橼酸离子含量差别较大，因此采用了标准曲线法来同时测定2家企业的产品，当只有1家企业样品时，也可采用外标法来测定。

本研究采用 HPLC 法检测猪源纤维蛋白粘合剂中纤维蛋白原和凝血酶两种成分的枸橼酸离子含量，操作简便，精密度、重复性、稳定性好，可更好地控制该药品的质量。

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