人结肠癌组织中VM、EMT及Wnt通路关键蛋白表达的相关性分析

杨 宏，乔 梦，李皓静，杜家乐，陈速研，罗丹阳，何 敏，张翠英

（1.内蒙古自治区人民医院肿瘤内科，内蒙古 呼和浩特010017；2.内蒙古医科大学）

结肠癌严重危害人类健康，肿瘤血管生成是结肠癌侵袭转移不可或缺的因素。最新研究表明血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry，VM）与肿瘤细胞的生长转移密切相关[1]。已有研究表明结肠癌组织中存在VM现象且存在VM的患者往往恶性程度高，易发生血道转移，预后差。VM形成的具体机制未完全明确，有研究认为上皮间质转化（epithelial.mesenchymal transition，EMT）在VM形成过程中发挥重要作用[2]。EMT是上皮细胞向间充质细胞转化的现象，会受到细胞信号转导机制精准调控，其中Wnt通路被认为是参与调控EMT的重要信号通路之一[3]。然而VM形成与Wnt通路是否存在关联仍不清楚。另外结肠癌中Wnt通路与EMT关系仍需验证。本研究通过免疫组化技术分别检测结肠癌病例组织中VM表达，同时检测EMT的标记蛋白Vimentin和E-cadherin的表达，检测Wnt通路调控蛋白βcatenin的表达。初步分析和研究结肠癌VM表达情况以及VM表达与临床病理特征的关系；分析VM与EMT两种标记蛋白表达的关系；分析VM与Wnt通路调控蛋白β-catenin表达的关系；分析β-catenin表达与EMT两种标记蛋白的关系，为进一步研究VM、EMT以及Wnt通路这三者之间的内在联系奠定初步基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018-01～2019-12期间我院收治的200例结肠癌患者的组织标本，所有入组患者均接受手术治疗，排除术前接受过放化疗的患者。患者中包括男性109例，女性91例，年龄范围25～74岁，平均年龄为（50.61±18.3）岁。收集所有患者临床病理资料，另由两位有经验的病理医师复阅切片并确认为结肠癌。

1.2 方法

采用CD34免疫组化染色与过碘酸-雪夫氏（PAS）染色法两种方法共同判定VM，PAS阳性且周围衬有肿瘤细胞，但CD34为阴性的管道结构被认为是VM（+），400倍镜下观察至少10个不同的视野判断结果[1]。

免疫组化SP染色测定EMT相关因子Vimentin、E-cadherin的表达，阳性染色结果判定：Vimentin＞10%，E-cadherin＞50%为阳性表达[4]。

免疫组化染色判定Wnt通路相关因子βcatenin表达情况。结果根据IRS系统进行评价：IRS（分值）=染色程度（SI）×阳性细胞比例（PP）。评判标准：0分，阴性，记为（-）；1分以上阳性，记为（+）[5]。

1.3 统计学方法

本研究采用SPSS 22.0软件，计数资料采用χ2检验；计量资料采用表示，采用t检验；检验水准为α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人结肠癌组织中VM表达情况分析

共检测200例结肠癌患者术后组织蜡块的VM表达情况。结果显示，结肠癌患者中的确存在VM现象，本研究200例结肠癌中有45例VM表达（+），且阳性表达者与较差的肿瘤组织分化、较高的临床分期及复发转移相关，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 结肠癌组织VM蛋白表达情况及临床特征关系（n）

2.2 人结肠癌组织中VM蛋白和EMT蛋白表达的相关性分析

本研究45例VM阳性的结肠癌组织中Vimentin为高表达率（66.7%），E-cadherin为低表达（15.5%）；而VM阴性中Vimentin为低表达（14.8%），E-cadherin为高表达（74.8%），（见表2）。统计学分析显示VM阳性组与阴性组中结肠癌细胞Vimentin和Ecadherin的表达差异均有统计学意义（P<0.05），提示存在VM的结肠癌组织中肿瘤细胞多发生EMT，二者具有相关性。

表2 VM与EMT标记蛋白表达之间的关系[n(%)]

2.3 人结肠癌组织中VM阳性与Wnt通路调控蛋白β-catenin表达的相关性分析

本研究45例VM阳性的结肠癌组织中，有27例（60%）β-catenin表达阳性，而VM阴性中只有13例（8.4%）β-catenin表达阳性（见表3）。VM表达在βcatenin阳性与阴性组的表达具有统计学差异（P<0.05）。提示VM表达与Wnt通路调控蛋白βcatenin表达具有相关性。

表3 VM表达与β-catenin表达的相关性[n(%)]

2.4 人结肠癌组织中β-catenin表达与EMT的两种标记蛋白（Vimentin、E-cadherin）表达的相关性分析

200例结肠癌组织中有40例β-catenin阳性，Vimentin为高表达（72.5%），而E-cadherin低表达（30.0%）；而β-catenin阴性中，Vimentin低表达（15.0%）而E-cadherin高表达（69.4%）（见表4）。经统计学分析表明β-catenin与Vimentin表达呈正相关（P<0.05），同时与E-cadherin呈负相关（P<0.05）。提示β-catenin阳性者更易发生EMT。

表4 Wnt/β-catenin信号通路状态有关蛋白和EMT蛋白表达的关系[n(%)]

3 讨论

美国学者于1999年首次在黑色素瘤的报道中提出了VM[6]现象，这种特殊现象在多种肿瘤中都可以观察到[7]。由于VM管道由肿瘤细胞直接围成因此肿瘤细胞更易突破基底膜快速进入血液利于肿瘤侵袭和转移[8，9]。一项纳入217例结肠癌患者的研究显示VM与肿瘤组织分化程度低、TNM分期晚以及高复发转移密切相关[10]。本研究结果显示，200例结肠癌组织中有45例VM阳性。其中VM阳性与结肠癌患者的年龄、性别以及肿瘤大小无明显相关，但与肿瘤分化差、临床分期晚及高复发转移密切相关（P＜0.05），这与既往研究结果一致。

上皮间质转化（EMT）与癌组织的VM关系密切。EMT发生过程中上皮细胞失去其上皮表型如E-cadherin、claudin等粘附蛋白表达下调导致细胞间桥粒连接减弱，同时获得间质特性如Vimentin、SMA等表达上调。本研究检测和比较了结肠癌组织中VM与EMT的两种标记蛋白Vimentin和Ecadherin的表达。VM阳性组Vimentin高表达而Ecadherin表达缺失，提示VM存在的结肠癌组织中癌细胞间充质表型上调而上皮表型缺失，因此推测VM阳性结肠癌更容易发生EMT。

Wnt通路是调控EMT的重要信号通路之一[11]，既然EMT参与肿瘤VM形成那么VM与Wnt通路是否相关值得关注。Wnt信号通路的激活在肿瘤发生中至关重要[12]。研究表明Wnt通路异常会引起血管发育异常和血管生成[13]。本研究初步分析VM与Wnt通路的调控蛋白β-catenin的关系，结果提示二者呈正相关，提示VM与β-catenin调控的Wnt/βcatenin信号通路之间可能具有相关性。

EMT在恶性肿瘤的进展和转移中发挥重要作用[14]。许多研究报道Wnt通路与EMT的发生密切相关[15，16]。为了验证结肠癌组织中Wnt通路与EMT的关系，本研究初步分析该信号通路的调节蛋白β-catenin与EMT的两个标记蛋白（Vimentin）、Ecadherin）表达的相关性。结果提示β-catenin调控的Wnt信号通路活化可能引起结肠癌细胞间质表型（Vimentin）上调和上皮表型（E-cadherin）下调，即β-catenin阳性更容易发生EMT。

综上所述，在结肠癌组织内存在VM现象，且VM阳性的结肠癌患者分化更差、临床分期更晚，更易发生复发转移。VM与Vimentin表达呈现正相关，与E-cadherin为负相关，提示VM与EMT密切相关。同时VM与Wnt信号通路的调控蛋白β-catenin表达呈正相关，提示VM与Wnt通路之间存在相关性。另外β-catenin与Vimentin表达为正相关但与E-cadherin负相关，提示结肠癌中Wnt通路异常活化可能促进EMT发生。本研究为进一步研究结肠癌组织中VM、EMT、Wnt通路三者之间的内在联系奠定了初步基础。