见血清种子形态结构特征

李国平，徐自坤

（1.武夷学院 生态与资源工程学院，福建 武夷山 354300 ；2.武夷山国家公园管理局，福建 武夷山 354300 ）

见血清（Liparis nervosa）为兰科羊耳蒜属植物，全草具凉血止血、清热解毒功效，为民间十大止血要药之一，广布于全世界热带与亚热带区域，在我国长江以南各省常见[1-2]。见血清在自然环境下繁殖率极低，加上人为过度采挖，野生资源破坏日益枯竭，利用种子进行无菌播种快繁是见血清保育研究的重要内容[3]。目前，国内学者在见血清植物学特性、化学成分及药理作用等方面进行了研究[4-6]，但至今尚未见对见血清种子形态结构的研究报道。通过对见血清种子形态结构、种皮成分及种皮破除处理方法的研究，以期为今后建立大规模繁殖技术的应用研究提供基础参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采集武夷山地区野生见血清成熟蒴果，取种子作为研究材料。

1.2 方法

1.2.1 种子形态大小观察

取成熟见血清种子制成水装片置光学显微镜（LeicaDM 2500 German）下观察并拍照，用显微测微尺法测量种子长宽以及种胚长宽（取30 粒种子的平均值）。按兰科种子体积计算公式计算以下参数[7-8]：

种子体积=2×[(W/2)2×(1/2L)π/3]；

种胚体积=（4/3 ）πab2(W 为种子的宽，L 为种子的长；a 为1/2 种胚长，b 为1/2 种胚宽)；

种胚占种子体积=种胚体积/种子体积×100% ；

气腔体积=(种子体积－ 胚的体积)/种子体积×100%

1.2.2 种子的整体透明染色与观察

参考李国平等[9]方法，观察见血清种子的结构特征，种子经FAA 固定、冲洗、1mol 盐酸水解后用稀释的爱氏苏木精染色液进行整体染色，经脱水后用水杨酸甲酯（冬青油）进行透明处理。将透明后种子置于滴有丁香油的载玻片上，用光学显微镜（LeicaDM 2500 German）观察并拍照。

1.2.3 种皮细胞壁成分的鉴定

种皮细胞壁成分的鉴定采用显微化学鉴别法[10-11]。以氯化锌-碘试剂鉴定种皮细胞壁纤维素成分，以盐酸—间苯三酚染液鉴定种皮细胞壁木质素成分，以苏丹Ⅲ酒精饱和溶液鉴定种皮细胞中角质和脂肪成分。

1.2.4 种子预处理和染色率测定

取成熟种子分别用浓度为0.5%、1%的氢氧化钠处理1～8 min，用清水冲洗干净后，再用醋酸洋红染色，置光学显微镜下观察、统计染色率。每处理100粒，3次重复。染色率=（染色数/种子总数）×100%

1.3 数据处理

用Excel进行数据分析。

2 结果和分析

2.1 见血清种子的形态与结构

见血清种子细如粉尘状，乳白色，呈狭长纺锤形，中间宽，两端渐细；种子长（1.178±0.028）mm，宽（0.122±0.017）mm，种子体积4.59×10-3mm3；种皮透明、膜质，具一层细胞，多呈长方形；胚位于种子中央，呈椭圆形，黄绿色，种胚长（0.189±0.029）mm，宽（0.079±0.011）mm，体积0.617×10-3mm3，种胚占种子体积13.44%；种子气腔体积占86.56%（图1a）。

成熟种子经整体染色、冬青油透明，可在光学显微镜下清晰显示种胚结构特征（图1b）。种子无胚乳，种胚具短柄。胚处于球形胚发育阶段，胚细胞呈球形，原生质浓厚，细胞核大。种皮为死细胞，呈透明状。

图1 见血清种子的形态与结构（a）示种子形态（10×）；（b）示种胚结构（40×）Fig.1 Seeds morphology and structure of Liparis nervosa（a）showing the seed morphology;（b）showing the seed embryo structure

2.2 见血清种皮细胞壁成分

见血清种子经碘—氯化锌染色法染色以后，种皮细胞壁染成蓝紫色（图2a），说明细胞壁中都含有纤维素；盐酸-间苯三酚染色反应呈桃红色（图2b），说明种皮细胞壁中含有木质素成分；苏丹Ⅲ酒精饱和溶液染色反应呈橘黄色（图2c），说明种皮细胞壁中含有角质成分。因此，见血清种皮细胞壁中含有纤维素、木质素和角质。

图2 见血清种皮细胞壁成分显微观察（a）碘-氯化锌溶液染色（20×）；（b）盐酸—间苯三酚溶液染色（40×）；（c）苏丹Ⅲ酒精饱和溶液染色（40×）Fig.2 The microscopical observation of cell wall components of Liparis nervosa seed coat（a）Staining with iodine-zinc chloride solution;（b）Staining with hydrochloric acid-resorcinol solution;（c）Staining with sudanⅢ-alcohol saturated solution

2.3 种子预处理对染色率的影响

用0.5%、1%的氢氧化钠处理见血清种子后进行醋酸洋红法染色，于显微镜下观察染色程度，结果如图3。

图3 不同浓度氢氧化钠处理对见血清种子染色率的影响Fig.3 Effects of different NaOH concentration on seed dyeing rate

用0.5%氢氧化钠处理1～3 min，观察不到种子胚着色；处理4 min后，种子胚开始着色，说明种皮开始受到破坏，染色液可以渗入种胚；处理6 min的染色率为（58.8±6.1）%，处理8 min的染色率达100%。用1%氢氧化钠处理2 min后，种胚即开始着色，处理4 min染色率可达100%，延长处理时间，种胚着色加深，而且种胚细胞受到了不同程度的破坏，说明氢氧化钠浓度对种胚染色率有显著影响。1%的氢氧化钠对见血清种皮有较强的腐蚀性。建议用0.5%氢氧化钠处理6 min作为见血清种子无菌播种培养前预处理的适宜参数。

3 讨论与结论

见血清的种子结构简单，由种皮和胚两部分构成，无胚乳，且胚发育不完全，处于球形胚阶段，这些特征与其他兰科植物种子的形态结构特征相吻合[7,12]。兰科植物种子在形状、大小、颜色、体积以及种皮、胚结构及相对比例等方面表现出多样性，其中兰科植物种子气腔占种子体积的大小具有重要的生态学意义[13-14]，气腔占种子体积的50%以上者为轻浮型种子，反之则为非轻浮型种子[8]。见血清的种子体积仅为4.59×10-3mm3，相对较小，且气腔体积占 种子体积的86.56%，属典型的轻浮型种子，适于长距离传播，这与见血清广布于全世界热带与亚热带区域的分布特征相吻合。

兰科植物种子具休眠特性，种皮的机械阻力和通透性差一直被认为是影响其萌发的主要因素之一。本研究中观察到见血清种皮细胞壁中含有纤维素、木质素和角质，这些物资在种皮上积累后大大降低了种皮的通透性，阻碍了种子对水分、氧气和营养物质的吸收，从而导致种子休眠。一些研究也表明，兰科植物种子发育后期珠被细胞开始积聚木质素，并最终纤维化和角质化[15-17]。

在自然条件下，兰科植物种子发芽率很低，只有感染了合适的真菌后才能萌发生长，真菌的作用一是破坏种皮，增加透水透气性，二是为胚胎细胞的发育通过营养物质。在兰科植物无菌播种与组织培养研究中，常用NaOH等化学试剂预处理以破坏种皮，促进种子萌发[18-19]。本研究实验表明，0.5%NaOH溶液一定时间可破坏见血清种皮促进种胚着色，推荐0.5%NaOH溶液处理6 min作为见血清种子无菌播种培养前预处理的适宜参数。一些研究者曾通过各种方法去除兰科植物种皮对种子萌发的限制，结果表明预处理可以提高种子的萌发率[18-21]。本研究应用一定浓度NaOH溶液处理结合醋酸洋红染色的方法，操作简单，实验历时短，实验结果明显，可很容易筛选得到适宜的化学预处理条件。该预处理初筛办法可为其它兰科植物种子非共生萌发研究提供参考。