探讨印迹基因原位检测技术在甲状腺结节精准化诊断中的应用

杨淑芳，周 宁，尹 明，朱正才，张树新，王 珏，顾彬，史爱梅，叶炳华

（1.泰州市第三人民医院；2.泰州市人民医院，江苏 泰州 225300；3.立森印迹诊断技术（无锡）有限公司，江苏 无锡 214000）

随着人们对健康的关注以及超声技术的进步，全球甲状腺结节发病率呈上升趋势[1]，虽然甲状腺癌的发病率也随之上升[2]，但我国近期的调查研究仍然显示，其预后良好，5年生存率在肿瘤病变中居首位[3]。所以临床工作中对甲状腺结节的诊治应强调精准诊断，避免过度医疗，超声引导下细针穿刺细胞学（fine needle aspiration cytology，FNAC）检查对甲状腺结节良恶性的判断具有重要临床价值，被国内外指南均推荐，但存在细胞学病理检查的局限性，BRAFV600E基因作为甲状腺癌最常见的遗传学突变，目前对甲状腺恶性肿瘤的诊断价值已得到临床认可[4]，但仅仅针对甲状腺乳头状癌具有特异性诊断价值，因此寻求更多的特异性肿瘤相关的基因检测标志物对于推动甲状腺结节的精准诊断具有重要意义。来源于表观遗传学领域的印迹基因及其控制机制的异常在人类遗传性疾病尤其是肿瘤发生中的作用正引起越来越多的注意，本研究通过对甲状腺结节患者的原位HM13印迹基因的检测，旨在探讨印迹基因在甲状腺结节良恶性病变鉴别诊断中的价值。

1 对象与方法

1.1 对象与分组本研究43例甲状腺结节患者来自我院内分泌科及甲乳外科住院病人，其中男性22 例，女性21 例，平均年龄（39.21±13.9）岁，本研究经医院伦理委员会批准，所有患者在穿刺术前均已签署知情同意书。病例入选标准：年龄16岁～75岁，（1）直径>1cm的甲状腺结节，并且超声检查TI-RADS 分级大于3 级以上考虑行穿刺活检。（2）直径≤1cm的甲状腺结节，不推荐常规行穿刺活检。但如果存在下述情况之一者，可考虑US-FNAB：超声检查提示结节有恶性征象；伴颈部淋巴结超声影像异常；童年期有颈部放射线照射史或辐射污染接触史；有甲状腺癌家族史或甲状腺癌综合征病史；18F-FDG PET 显像阳性；伴血清降钙素水平异常升高；患者本人有强烈穿刺意愿者。此外若甲状腺结节大于2cm，可考虑直接粗针穿刺病理。其中甲状腺超声的恶性征象判断根据甲状腺TI-RADS 诊断标准：0 级：无结节，表现为正常甲状腺或弥漫性增生性甲状腺；1 级：高度提示良性，以囊性为主，有声晕；2级：可能良性，边缘界限清楚，以实性为主，回声不均匀，等回声或高回声，蛋壳样钙化或粗钙化；3 级：不确定，回声均匀，低回声，边缘光整，实性，纵横比>1，无其他提示恶性的超声图像；4 级：可能恶性，1～2 项提示恶性的超声表现，如极低回声，微钙化，边缘不光整，淋巴结异常；5 级：高度提示恶性，超过3项提示恶性的超声表现，如极低回声，微钙化，边缘不光整，边界不清，淋巴结异常等。排除纯囊性结节、细针穿刺术前凝血功能异常者、术前未停服阿司匹林等抗凝药品或停药时间未达标准者。

1.2 研究方法使用GE E9彩色超声诊断仪，探头频率9～15MHz，针吸所用器材选用一次性穿刺活检针（规格PA 23/8，型号：23G×80mm）。患者取仰卧位，充分暴露颈部；常规消毒铺巾，超声实时观察进针，每个结节穿刺2～3针，每一针在结节内朝多个方向穿刺3～5次，并进行负压抽吸。分别穿两次，第一次穿刺所得样本立即涂片进一步行细胞病理学检查。FNAC细胞病理诊断结果分为以下4类：（1）未诊断：标本取材不佳，涂片内未见足够细胞成分，无法作出诊断；（2）良性病变：能够肯定为非肿瘤性疾病的诊断；（3）可疑恶性：滤泡性肿瘤和嗜酸细胞性肿瘤，以及存在某些提示恶性的细胞学特征，但还不能确诊；（4）恶性：能够肯定为恶性的诊断。将良性病变视为阴性结果，可疑恶性及恶性视为阳性结果。第二次甲状腺的细针穿刺样本立即用10%中性福尔马林在室温下固定48小时。离心除去上清后重悬细胞，滴加于带正电的载玻片上，在50℃的烘箱内烘干。按照RNAscope 试剂盒（ACD Bio）说明书进行样本预处理[5]，以HM13基因的内含子为靶点设计探针[6]，使用RNAscope 2.5 HD assay kit（ACD Bio）的步骤进行原位杂交和信号扩增，对细胞核的数量进行计数，根据结果进行打级，0-I级为良性，II-IV级为恶性。

1.3 统计学处理采用SPSS26.0版统计软件对数据进行统计分析，以术后病理学结果为“金标准”，计数资料的比较采用χ2检验，进行Kappa分析诊断一致性检验，以P<0.05 为差异有统计学意义，计算两种诊断方法单一或联合检测的灵敏度、特异度及准确率，最后评价两种检查方法的诊断价值。

2 结果

2.1 甲状腺结节术后病理结果44个甲状腺结节术后病理诊断为甲状腺乳头状癌30个（12个为微小乳头状癌），甲状腺髓样癌1个，甲状腺滤泡状癌3个，良性结节10个。

2.2 FNAC与HM13印迹基因检测结果（见表1，表2）以术后病理为“金标准”，44 个甲状腺结节FNAC 诊断的敏感度、特异性、准确性，见表2；HM13 印迹基因检测诊断的敏感度、特异性、准确性，见表2；FNAC 与HM13 印迹基因使用并联方式联合检测可提高敏感度至100%，FNAC 与HM13印迹基因使用串联方式联合检测可提高特异性至100%。

表1 FANC与HM13印迹基因检测与术后病理结果（个）

表2 FANC与HM13印迹基因及FANC联合HM13检测结果

2.3 FNA和HM13印迹基因检测与术后病理诊断一致性Kappa 检验结果（见表3）FNAC 检测结果与术后病理结果检测一致性吻合度最高，单一HM13 印迹基因与术后病理检测结果吻合度一般，如果联合FNAC检测可提高HM13印迹基因与术后病理结果的吻合度，两种检测方法诊断一致性检验均有统计学意义。

表3 FANC、HM13印迹基因与术后病理结果的Kappa检验结果

3 讨论

甲状腺结节是内分泌科及外科常见疾病，自身免疫性疾病、甲状腺炎性反应、甲状腺肿瘤、甲状腺退行性变等均可引起甲状腺结节性病变[7]，甲状腺结节在人群中的检出率为20%～76%，其中恶性肿瘤仅占7%～15%。按病理类型可分为乳头状癌（PTC）、滤泡状癌（FTC）、未分化癌（ATC）和髓样癌（MTC）。其中，PTC与FTC合称为分化型甲状腺（DTC），目前甲状腺结节的检出率呈上升趋势，早期准确诊断，尤其是甲状腺肿瘤中良、恶性结节的鉴别，对正确选择干预措施及改善患者预后同时避免过度医疗起着至关重要的作用。甲状腺恶性结节性质的诊断方面目前尚无很好的特异性生物化学指标，国内外指南均推荐甲状腺结节穿刺技术对于甲状腺结节性质判断的必要性[8,9]。但由于FNAC 检查取材较少，采用的是细胞学检查，而细胞学检查脱离了组织形态，有时即使是经验丰富的病理专家亦难以诊断，所以在临床实践中甲状腺细针穿刺细胞学检查仍有相当一部分难以判断其良恶性。甲状腺粗针穿刺对结节大小有要求，并且创伤性较细针大，同时对操作者的技术有较高要求，所以在临床上并没有被广泛开展。

近年来，针对甲状腺恶性肿瘤的分子学及基因研究也逐渐在深入，如BRAFV600E基因突变与甲状腺乳头状癌的发生显著相关等等[10]，研究人员由此得出结论，基因检测分类法是对甲状腺结节一种值得考虑的更保守的诊断方法，深入研究可提高甲状腺结节精准化诊断水平。本研究课题开展的印迹基因属于表观遗传学，印迹基因及其控制机制的异常在人类遗传性疾病尤其是肿瘤发生中的作用正引起越来越多的注意[11]，有学者发现HM13 印迹基因是可以确定的高表达癌症的基因，在乳腺癌和腰椎等肿瘤疾病中，HM13显示出了异常的过度表达[12]。

基于上述理论和实践研究，本项目研究病例基于在超声引导下甲状腺穿刺病理并且取材进行HM13印迹基因检测后手术的甲状腺结节患者，结果提示本研究中FNAC结果的灵敏度82.4%，特异度高达100%,符合既往文献报道的灵敏度65%～98%、特异度72%～100%[13]，一致性检验也提示FNAC的吻合度最高，提示甲状腺细针穿刺病理目前在甲状腺结节良恶性诊断中的重要性和必要性地位不能动摇，符合临床指南要求。HM13印迹基因在甲状腺结节良恶性诊断中的敏感性高达93.9%，高于FNAC 检测的敏感度，提示HM13 印迹基因的应用对于甲状腺恶性结节的检出率可能优于FNAC，具有临床意义，但特异性仅50%，低于FNAC，可能与本实验样本例数偏少以及良恶性分期诊断尚不够精细有关，HM13 印迹基因和FNAC 的不同联合检测方式均可提高HM13印迹和FANC单一检测的敏感度和特异性，提示HM13印迹基因在甲状腺结节良恶性的诊断中具有重要的辅助诊断价值。在一致性检验结果中可以看出HM13与术后病理的吻合度一致，但程度一般，可能尚需更大样本的深入研究。此外粗针病理学检查结果虽然与术后病理结果吻合度可达100%，但由于其操作的技术要求，其临床应用难以广泛推广。

综上所述，FANC与印迹基因两种检查方法在甲状腺良恶性的鉴别诊断中均具有临床价值，甚至HM13 印迹基因检测具有更高的灵敏度及准确率。原位印迹基因检测技术可以弥补FNAC 检测的不足，具有一定辅助诊断价值，其临床应用可促进甲状腺结节患者精准化诊断水平。