7批北苍术样品药效组分的高效液相色谱测定

文 君，赵雅芬，冯莹莹，田晔林，王建舫*

(1. 北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室/动物类国家级实验教学示范中心， 北京 102206；2. 北京农学院园林学院，北京 102206)

苍术为菊科植物茅苍术(Atractylodeslancea(Thunb.) DC.)或北苍术(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)的干燥根茎。春季和秋季采挖，除去泥沙，晒干，撞去须根。具有燥湿健脾，祛风散寒，明目之功效。用于湿阻中焦，脘腹胀满，泄泻，水肿，脚气痿蹵，风湿痹痛，风寒感冒，夜盲，眼目昏涩[1]。目前，对苍术化学成分的定量分析方法主要有气相色谱(Gas Chromatography，GC)和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)等[2]。对于同时定量检测苍术中苍术素、苍术酮和β-桉叶醇分析方法主要是GC法，HPLC法和其他方法文献报道较少。目前研究人员利用GC法分别建立同时检测苍术素、苍术酮和β-桉叶醇含量的方法[2-9]。此外，曹琰等[10]、欧阳臻等[11]、曾志等[12]用气相色谱仪串联质谱检测器建立同时测定β-桉叶醇、苍术素和苍术酮含量的方法。为了进一步提高检测灵敏性，陆奇杰等[13]、李琴瑜等[14]、孙金等[15]用HPLC法分别建立同时检测苍术素、苍术酮、β-桉叶醇含量的方法，建立的检测方法虽然在检测灵敏度具有一定的优势，但却存在出峰时间过长或需要多波长检测等不足。为了建立一种检测方法简单、易于操作和灵敏度较高的方法，本研究探讨利用HPLC检测北苍术中β-桉叶醇、苍术酮和苍术素含量，建立用同一波长检测北苍术中这3种成分的方法，为中国传统中药成分的提取和检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 仪器与试验材料

高效液相色谱仪(Waters e2695)，二极管阵列检测器(Waters 2998)，Empower2软件(Waters公司)；电子天平(AL104，梅特勒公司)；数码超声波清洗器(KQ5200DV，昆山市超声仪器有限公司)；防腐隔膜真空泵(GM 0.33 A，天津市津腾实验设备有限公司)；溶剂过滤器(1 L，天津市津腾实验设备有限公司)。

β-桉叶醇对照品，批号：190612；苍术素对照品，批号：19072205；苍术酮对照品，批号：18110201；均购自成都普菲德生物技术有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯，均购自赛默飞世尔科技有限公司。7批次北苍术样品经北京农学院园林学院田晔林鉴定为北苍术，信息见表1。

表1 北苍术样品信息Tab.1 Sample information of Atractylodis Rhizoma

1.2 色谱条件

色谱柱YMC-Pack ODS-A (150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈 58.5，0～20 min；58.5～85，20～60 min；10%甲醇41.5，0～20 min；41.5～15，20～60 min。检测波长200 nm。流速1.0 mL/min。柱温26 ℃。

1.3 溶液的配制

1.3.1 混合对照品溶液的配制 精密称取10 mg β-桉叶醇对照品，放入10 mL锥形瓶，加入10 mL甲醇，定容，混匀，命名为溶液1。精密称取苍术素对照品5 mg，苍术酮对照品5 mg放入5 mL锥形瓶，加入5 mL溶液1，定容，混匀。此时，甲醇溶液中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的质量浓度均为1 mg/mL，命名为混合对照品溶液A；精密量取1 mg/mL混合对照品溶液A 2.5 mL加入到5 mL锥形瓶，加入2.5 mL甲醇，混匀，此时混合对照品溶液的质量浓度均为0.5 mg/mL；精密量取0.5 mg/mL的混合对照品溶液2.5 mL加入到5 mL锥形瓶，加入2.5 mL甲醇，混匀，此时混合对照品溶液的质量浓度均为0.25 mg/mL；依次类推，直至进行到8个倍比稀释。加上混合对照品溶液A,得到9个质量浓度梯度的混合对照品溶液B，质量浓度分别为1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0157、0.0079、0.0040 mg/mL。

精密吸取4 mL溶液1，加入4 mL甲醇，混匀；从中吸取5 mL，加入3 mL甲醇，混匀，命名为溶液2。精密称取苍术素对照品5 mg，加入10 mL甲醇，混匀；从中吸取5 mL，加入5 mL甲醇，混匀，命名为溶液3。精密称取苍术酮对照品5 mg，加入10 mL甲醇，混匀；从中吸取5 mL，加入3 mL甲醇，混匀，命名为溶液4。精密量取5 mL溶液2，2.5 mL溶液3，2.5 mL溶液4，配制成混合对照品溶液C。

1.3.2 北苍术样品溶液的配制 取北苍术样品粉末，过3号筛(孔径270 μm)，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)，40 ℃，1 h，放冷，再称定，用甲醇补足损失的质量，摇匀，用孔径74 μm滤网过滤，即得[1]。

1.4 方法学考察

1.4.1 专属性测定 分别精密吸取0.1250 mg/mL的混合对照品溶液和北苍术样品溶液10 μL进样，用Empower2软件计算混合对照品和北苍术样品中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的保留时间，北苍术样品的分离度和理论塔板数，导出混合对照品和北苍术样品的色谱图。

1.4.2 线性关系测定 分别取9个质量浓度梯度的混合对照品溶液B 2 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤到进样瓶中，自动取10 μL进样，用Empower2计算峰面积。以混合对照品(mg/mL)为横坐标，以峰面积(μv×s)为纵坐标，用Excel 2016软件做出混合对照品线性关系图。

1.4.3 精密度、重复性和稳定性的测定 精密吸取0.1250 mg/mL的混合对照品溶液10 μL，用“1.2”的色谱条件，连续进样6次，用Empower2软件计算峰面积，用Excel 2016软件计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，进行精密度的测定。精密吸取北苍术样品溶液，连续进样6次，每次10 μL，计算峰面积和RSD，进行重复性的测定。设置程序分别在0、2、4、6、8、24 h进样，每次10 μL，计算峰面积和RSD，进行稳定性的测定。

1.4.4 加样回收的测定 分别称取0.25 g北苍术样品粉末，按照“1.3.2”的方法制备6个北苍术样品溶液，各精密吸取1 mL，分别加入1 mL混合对照品溶液C，混匀，此为6个加样回收溶液。分别精密吸取10 μL混合对照品C、6个北苍术样品溶液和6个加样回收溶液，注入高效液相色谱仪，分别测定，计算各成分的含量。按照2020版《中国药典》关于回收率的计算方法进行计算。

1.5 北苍术样品含量测定

分别精密称取北苍术样品0.25～0.3 g，制备方法按“1.3.2”进行，色谱条件按“1.2”进行测定，用Empower2软件计算峰面积，然后以外标法计算北苍术样品中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性试验 北苍术样品中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的保留时间与相应的对照品基本一致，且β-桉叶醇、苍术素和苍术酮与前后峰的分离度均大于2020版《中国药典》规定的1.5；北苍术样品中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的理论塔板数分别为16284、14939和49778(图1)。

2.1.2 线性关系试验 混合对照品线性关系见图2。β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的线性方程分别为y=2E+07x+39661，y=8E+07x+316345，y=2E+07x+17758；R2分别为0.9998、0.9992和0.9999。

2.1.3 精密度、重复性和稳定性试验 精密吸取0.1250 mg/mL的混合对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的RSD分别为0.24%、0.23%、0.20%，表明精密度良好。

精密吸取北苍术样品溶液，连续进样6次，每次10 μL，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的RSD分别为1.50%、1.38%、0.85%，表明重复性良好。

分别在24 h的不同时间内精密吸取北苍术样品溶液6次，每次10 μL，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的RSD分别为0.98%、1.32%、1.11%，表明北苍术样品在24 h基本稳定。

2.1.4 加样回收试验 加样回收结果见表2。β-桉叶醇、苍术素和苍术酮平均回收率分别为99.07%、100.18%和100.81%，RSD分别为1.17%、0.73%和1.36%。β-桉叶醇、苍术素和苍术酮平均回收率符合2020版《中国药典》规定的92%～105%的标准，表明回收合格。

表2 加样回收结果Tab.2 Sample recovery rate

2.2 北苍术样品含量测定

7批北苍术样品，每批3个重复，用高效液相色谱仪进行测定，北苍术中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮含量见表3。陕西商洛的β-桉叶醇含量最高，为30.9835 mg/g，内蒙古2的含量最低，为3.7621 mg/g。内蒙古赤峰的苍术素含量最高，为4.4167 mg/g，陕西商洛的含量最低，为0.2481 mg/g。河北的苍术酮含量最高，为8.4834 mg/g，陕西安康的含量最低，为0.5015 mg/g。在所有北苍术样品中，陕西商洛的β-桉叶醇含量最高，为30.9835 mg/g，而苍术素含量却最低，为0.2481 mg/g。

表3 北苍术样品3种成分测定结果(n=3)Tab.3 Determination results of three components in Atractylodis Rhizoma (n=3)

3 讨 论

3.1 波长的选择

用190～400 nm波长对β-桉叶醇、苍术素和苍术酮对照品进行扫描分析，发现β-桉叶醇在195 nm处吸光度最大，然后逐渐减小。苍术素的吸收范围较广，在336 nm处有最大吸收。在200～210 nm之间，苍术酮吸光度逐渐减少，到110 nm处到达低点，然后逐渐升高，到221 nm处到达高点，然后逐渐降低，直到没有光吸收。综合考虑，选择200 nm作为吸收波长。

3.2 流动相比例的选择

在波长200 nm、流速1.0 mL/min、柱温26 ℃和柱子规格型号等条件不变的前提下，只改变乙腈和10%甲醇比例，乙腈和10%甲醇比例分别为65∶35、60∶40、59.5∶40.5、59∶41、58.5∶41.5、58∶42、55∶45。发现3种目的成分的出峰时间顺序均为β-桉叶醇、苍术素和苍术酮，但是只有乙腈和10%甲醇比例为58.5∶41.5时，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮与前后峰的分离度均大于2020版《中国药典》规定的1.5，此时β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的保留时间分别为15.098、18.442、46.042 min。因为在苍术素与苍术酮保留时间之间很长时间看不到其他成分，故调整20～60 min乙腈与10%甲醇比例为58.5∶41.5～85∶15，此条件下β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的保留时间分别为15.054、18.385、37.654 min。调整20～60 min乙腈与10%甲醇比例后，β-桉叶醇和苍术素的保留时间基本没有变化，而苍术酮的保留时间缩短了8.388 min，并且苍术酮与前后峰的分离度均大于1.5。从而筛选出本试验的最佳流动相比例。

本试验建立了用高效液相色谱同时检测北苍术中β-桉叶醇、苍术素和苍术酮含量的方法，该方法简单、准确，为高效液相色谱用于北苍术的质量检测提供方法学保障。