FTO在帕金森病细胞模型中调控机制作用研究

蔺佳

(1. 新乡医学院药学院，河南 新乡 453000；2. 新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453000)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种临床上常见的老年神经退行性疾病，其发病特征主要是黑质的多巴胺能神经元变性和过度死亡，以及因此引起的纹状体多巴胺能神经元数量减少。肌肉强直、运动迟缓、静止性震颤及姿势步态障碍等为其主要临床表现，帕金森病的治疗目前主要是对症治疗，治疗效果也因病情的不同而有明显不同[1-3]。患者在患病后，生活质量会随着病情的加重而出现不同程度的下降，在疾病后期会发生多种并发症，甚至致残，从而导致预后不良[4]。目前认为，该病的发病机制与神经元内α-syncline的异常聚集密切相关[5]。但其详细的发病因素，尤其是非基因突变的病理因素仍不十分清楚。

众所周知，真核细胞中的RNA上有超过100种化学修饰，其中m6A是在真核生物mRNA和lncRNA中含量最为丰富的一种修饰碱基[6-7]。在哺乳动物细胞中，平均每个mRNA上约有3～5个m6A碱基。研究发现mRNA甲基化的形成是一个可逆过程，甲基转移酶和去甲基化酶共同作用调控了mRNA上m6A的含量变化[8]。其中m6A甲基转移酶是一个复合物，它主要由METTL3(methyltransferase like 3)、METTL14(methyltransferase like 14)和WTAP(Wilms tumour 1 associating protein)三部分构成[9]。RNA去甲基化酶主要有FTO(fat mass and obesity associated protein)和 ALKBH5(alkylation repair homolog 5) ，并且FTO和ALKBH5都是铁离子和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶[10]。mRNA上的m6A碱基在胞质会被不同的“reader”蛋白读取，然后引发不同的效应。在帕金森病中，相关基因mRNA的m6A修饰状况如何，是否也存在表观转录组学层面的调控？对此问题的详细研究还较少，有许多未知需要去探索[11-12]。因此，本实验研究6-OHDA诱导的帕金森损伤神经元中m6A含量的变化，并检测了调控m6A的甲基转移酶和去甲基化酶的表达水平，探究m6A修饰在帕金森细胞模型中可能的作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1试剂和仪器 细胞总RNA所用提取试剂盒购自天根生物；实验所用胎牛血清购买自Hyclone公司；DMEM高糖培养基购自GIbico公司；所使用PCR引物均购自于上海生工，详细序列见表1；实验使用FTO siRNA的相关序列为：5′-GCAGTGTATCTGAGGAGCTCCATAA-3′；所用m6A抗体(ab2085-77)购自abcam公司。FTO抑制剂FB23-2由华盛顿大学李静副教授惠赠。

1.1.2细胞株 本实验所使用的SHSY-5Y细胞株，购自上海生化细胞所。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组 实验中按照双抗∶胎牛血清∶DMEM高糖培养基=1∶10∶90的比例来培养SH-SY5Y细胞，之后置于20% O2、5%CO2，37℃细胞培养箱中正常培养，隔夜换液。培养至2～3 d时使用胰蛋白酶对SH-SY5Y细胞进行消化传代(1∶4)。取处于对数生长期状态良好的细胞进行实验。设空白对照组和6-OHDA处理组，调整细胞密度为1×105个/毫升，之后每孔按照150 μl接种于96孔板，根据相关文献[8]描述，对6-OHDA组以0.025 mg/ml的6-OHDA孵育24 h进行损伤诱导处理，各浓度设置6个副孔，然后取样进行相关实验。对于FB23-2处理过程，则将0.1 μM的FB23-2再收集细胞进行相关实验。

1.2.2CCK8实验检测细胞活力 取处于对数生长期的SH-SY5Y细胞进行实验。之后调整细胞密度，设置空白对照组和6-OHDA实验组。根据预实验，6-OHDA组以0.025 mg/ml的6-OHDA孵育进行损伤诱导处理，各组并设置6个副孔。之后在细胞培养箱中培养24 h后，直接每孔加入10 μl CCK8试剂，再置培养箱中继续培养4 h，最后使用酶标仪测定每孔在450 nm处的吸光度。

1.2.3LDH法检测细胞毒性 将被检测的细胞进行损伤诱导处理后，按照LDH检测试剂盒的步骤要求，对照组和实验组各做6个复孔，每孔各抽取50 μl上清液加至一个新的酶标检测板中；之后加入配好的底物缓冲液50 μl，避光孵育30 min后，每孔加入50 μl终止液，最后在490 nm处进行吸光度检测。

1.2.4Real-time PCR法检测SH-SY5Y细胞中甲基化相关酶mRNA表达 先根据Total RNA Kit试剂盒操作说明分别抽提对照组和实验组细胞的总RNA。之后取各组总RNA各1 μg，进行去除基因组反应和逆转录反应，从而合成cDNA，之后以cDNA为模板进行PCR扩增。具体操作根据试剂盒所带说明书和仪器操作说明书[PCR反应体系10 μl：cDNA 1 μl，primers(10 μmol/L)0.5 μl，2×Taq PCR MasterMix 5 μl，RNase Free water 3 μl]，PCR引物见表1。PCR反应条件为DNMT1：预变性95℃ 7 min，变性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸60℃ 30 s，循环数为40次。本实验中以GAPDH为内参基因，目的基因的相对表达量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct内参)实验组-(Ct靶基因-Ct内参)对照组。每个目的基因进行3次重复试验，最终以Ct值做统计分析。见表1。

表1 PCR所用引物

1.2.5Western blot法检测两种细胞与凋亡相关的蛋白酶表达 首先分别将两种细胞用含1%PMSF的RIPA(强)蛋白裂解液进行裂解，后用考马斯亮蓝结合法进行蛋白质含量定量。每组按照浓度的大小加入不同体积的PBS缓冲液和蛋白上样缓冲液调至各组蛋白浓度一致，之后10%SDS-PAGE电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部停止，转移至PVDF膜(100 V，2 h)，预染蛋白marker确定蛋白分子量标准位置。含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1 h，抗体METLL14(Proteintech，26158，1∶1000)、METTL3(Abcam，195352，1∶1000)、FTO(Abcam，ERP6894，1∶1000)、ALKBH5(Abcam，ERP18958，1∶1000)，GRIN1(Biorbyt，131784，1∶1000)β-actin(Sant Cruz，水槽30656，1∶5000)分别用封闭液按比例稀释后，放置室温摇床上摇30 min，之后4℃孵育过夜。第2天TBST洗涤3次，每次10 min；二抗(1∶5000)室温孵育1 h。再用TBST洗涤3次，每次10 min。最后使用天能凝胶成像机进行ECL曝光。ChemiScope analysis软件分析各个目的条带与β-actin条带的灰度比值，从而计算蛋白相对表达量。

1.2.6HPLC-MS法检测m6A含量 按照实验要求抽提细胞总RNA，之后用mRNA富集试剂盒对mRNA进行富集，随后对mRNA进行酶降解后用碱性磷酸酶除去磷酸集团，自备单碱基检测液，然后进行检测。

1.2.7小鼠帕金森模型的建立 将AAV介导shFTO定位注射在B6小鼠纹状体，并确定敲降结果。野生型小鼠和纹状体FTO基因敲降小鼠各8只，均腹腔注射1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)，根据密度换算，即每只小鼠每日腹腔注射剂量为 0.01 ml/kg(25 mg/kg，每周2次)，连续14 d，建模成功后，进行行为学检测：爬杆实验：将两组小鼠分别悬挂于一根长线上，其评分标准为，小鼠双后肢勾住挂线记为3分；小鼠仅一只后肢勾住电线记为2分，小鼠双后肢均未勾住电线记为1分。并且记录小鼠从悬挂到掉落的时间，即为潜伏期时长。转棒实验：将小鼠分别放在转棒疲劳仪，在转棒上进行适应性放置30 s后，启动疲劳仪，转速为5 r/min，让小鼠适应性90 s后，将疲劳仪转速调整为16 r/min，记录小鼠从转棒上第一次跌落的时间。最后分别收集小鼠的纹状体检测人合氨酸受体亚基(GRIN1)表达水平，以及氧化还原应激相关指标，本研究中小鼠处置方式均符合动物伦理学规定。

2 结果

2.16-OHDA诱导的模拟PD神经元损伤模型 实验结果显示0.025 mg/ml的6-OHDA会明显诱导SH-SY5Y细胞损伤，CCK8和LDH法检测都表明了0.025 mg/ml 6-OHDA所致的细胞毒性(图1A和1B)。细胞形态的变化(见图1C)，表明6-OHDA造成了显著的细胞损伤，符合PD的细胞模型。

注：A：CCK8检测细胞活力；B：LDH检测细胞毒性；C：细胞形态；**表示P<0.01。

2.26-OHDA对细胞中甲基转移酶mRNA和m6A含量的影响 qRCR检测6-OHDA诱导的神经细胞中表达的与m6A相关的甲基转移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO、ALKBH5的mRNA含量的变化(见图2A)，发现只有FTO在细胞内显著升高。同时检测了它们的蛋白表达水平(见图2B)，结果与mRNA表达水平一致，仅有FTO发生显著变化。HPLC-MS法直接检测正常细胞和PD模型细胞mRNA中m6A的含量变化，发现6-OHDA组虽然有一定程度的下降，但没有显著性差异(见图2C)，这可能和细胞内m6A动态调控的复杂机制有关。

注：A：mRNA的相对表达量；B：蛋白的相对表达量；C：m6A相对含量；**表示P<0.01。

2.3FTO敲低或过表达不影响PD发病相关基因的表达 在确定帕金森模型细胞中FTO升高之后，那么6-OHDA处理诱导的FTO表达升高是否会影响PD发病相关基因的表达水平，为验证该假设，通过siRNA敲低FTO的表达并用慢病毒构建了FTO高表达细胞株，观察在6-OHDA处理24 h后，FTO敲低和过表达对PD疾病密切相关基因的表达变化，结果显示无论敲低或过表达FTO，与PD疾病密切相关基因的表达与对照组相比没有显著性变化(见图3A、图3B和图3C)。

注：A：FTO的敲低和过表达效率；B：FTO敲低后对PD模型细胞中PD相关基因表达的影响；C：FTO过表达后对PD模型细胞中PD相关基因表达的影响。

2.4FTO对多巴胺信号通路相关基因GRIN1的表达变化的影响 为了进一步探究6-OHDA是如何通过调控FTO，诱导了哪些与PD疾病相关的变化，我们对一些多巴胺信号通路相关基因进行了检测，结果显示SH-SY5Y细胞在6-OHDA处理的情况下，过表达FTO则促进GRIN1的表达，mRNA和蛋白的检测结果是一致的(见图4A和图4B)；与此相反，敲低FTO后，GRIN1表达明显减少。同时我们使用了FTO抑制剂 结合前面的实验结果，猜测6-OHDA处理升高了FTO的表达，而高表达的FTO又导致多巴胺通路相关基因GRIN1发生改变。

注：A：mRNA的变化；B：蛋白含量的变化；B、C：FTO抑制剂处理后GRIN1的mRNA表达变化；*表示P<0.05

2.5敲降FTO基因降低了帕金森模型小鼠脑中GRIN1的表达 为在动物模型上验证上述结果，纹状体FTO敲降小鼠和野生型对照被腹腔注射MPTP造成帕金森病模型，通过动物行为学实验检测发现，在悬尾实验中，FTO敲降小鼠的得分比野生型小鼠要高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图5A；但悬尾实验中FTO敲降小鼠的潜伏期要长于野生型小鼠(P<0.05)，见图5B。在转盘实验中，FTO敲降小鼠的掉落时间要远远长于野生型小鼠(P<0.05)，见图5C。表明FTO敲降对帕金森模型小鼠有一定的意义。另外取出小鼠纹状体，检测GRIN1的表达，与细胞模型上的结果类似，GRIN1也有一定程度的降低(P<0.05)，见图5D。这表明在帕金森疾病模型中 FTO的水平会直接调控GRIN1的表达。

注：A：悬尾实验的评分结果；B：悬尾实验潜伏期；C：转棒实验的掉落时间；D：小鼠纹状体中GRIN1的mRNA

3 讨论

PD的发生过程中会伴随着许多基因表达的变化，越来越多的研究表明表观转录修饰在PD的发生发展过程中扮演了非常重要的角色[13-14]。现有研究表明，RNA甲基化可能与神经退行性疾病的病变有着紧密的联系[15]。但相关的研究主要集中在m6A和神经突触维持之间的关系，还没有详细的关于PD病理过程中m6A含量变化和机制的研究[16-17]。因此本文初步探讨了PD细胞模型中m6A相关的甲基转移酶和去甲基化酶的表达变化。本课题采用了经典的6-OHDA法诱导SH-SY5Y细胞，作为PD模型细胞。CCK8法和LDH检测法结果显示0.025 mg/ml的6-OHDA会导致SH-SY5Y细胞产生明显的损伤，这和PD患者内多巴胺能神经元减少类似。综上所述，我们认为0.025 mg/ml的6-OHDA处理可以有效地模拟PD细胞损伤。首先qPCR法检测了6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞中m6A相关酶FTO、ALKBH5、METTL3、METTL14的mRNA表达量的变化，结果显示大部分甲基转移酶和去甲基化酶没有明显变化，仅FTO有明显的表达升高。Western-blot检测了对应的蛋白表达，结果与mRNA一致，仅仅FTO明显升高。FTO作为一个去甲基化酶，在m6A形成的动态调节中具有重要作用。脑内FTO的过高表达可降低神经元内一些基因的mRNA中m6A的含量，导致下游基因表达的改变，最终可能引起一系列脑损伤病变[18-20]。最近研究表明，FTO的异常表达将影响学习记忆、昼夜节律等，并猜测可能与一些神经退行性疾病的发病有一定的相关性[21-22]。我们又用HPLC-MS检测6-OHDA对SH-SY5Y细胞中m6A的含量的影响，结果显示6-OHDA可以降低细胞中m6A的含量，虽然差异无统计学意义。这很可能是因为细胞内m6A的调控机制比较复杂，还存在其他潜在的调控机制。

后续主要以FTO为6-OHDA的主要影响靶点，首先用siRNA敲低FTO，同时用制作FTO高表达细胞株；并检验了敲低和过表达效果，然后检测了6-OHDA对正常细胞、siFTO和FTO过表达细胞的影响，我们着重观察了和PD发病相关的PINK1、parkin、SNCA和DJ1的mRNA表达量，发现差异无统计学意义，这可能是因为m6A的动态调控机制比较复杂，其写入和擦除受到多种酶和细胞因子的共同调控[23]。因此仅仅敲低或过表达FTO，在6-OHDA诱导损伤的细胞中与PD疾病密切相关基因的mRNA上甲基化位点还是得以保存，才会导致其表达基本不变，通过查询相关研究的文献[8]，我们又检测了与多巴胺信号通路相关的其他一些基因，经过筛选，实验结果显示敲低FTO导致GRIN1有较为明显的下降，而升高FTO则促进其表达，mRNA和蛋白水平的检测结果是一致的，而过表达FTO则会在一定程度的升高该基因的mRNA水平。以此我们推测FTO可能是通过调控多巴胺信号通路相关基因GRIN1在PD中发挥了一定的作用。GRIN1 基因能够表达离子型谷氨酸受体NMDAR1，致使Ca2+大量内流，造成神经元内Ca2+超载，触发一系列 Ca2+相关的级联反应，如氧化应激水平升高，线粒体功能损伤加剧等。在纹状体FTO敲低的帕金森模型小鼠脑内，我们也发现了类似效果，证明FTO在小鼠体内和体外均可对GRIN1的表达产生影响。但FTO是否直接减少了GRIN1 mRNA上的m6A并且GRIN1 mRNA上的m6A又是被哪种阅读蛋白读取，其具体的机制还需要进一步的研究。

综上所述，我们观察了6-OHDA诱导的神经细胞中m6A的含量差异，也观察了相关的甲基转移酶和去甲基化酶的表达变化，我们发现了FTO在6-OHDA损伤中有一定表达升高，并且利用siRNA敲低FTO后，最终发现多巴胺信号通路相关基因GRIN1在FTO敲低的情况下有显著的下调，而升高FTO则会促进FTO的表达。因此我们推测，FTO可能通过调控GRIN1的表达，在PD的发病过程中发挥了一定的作用。

致谢：该项目被河南省自然科学基金“Sirt6经LKB1/AMPK/PGC1a/NRF上调线粒体生物合成”(编号202300410325)支持。