环丝氨酸与其他二线抗结核药物体外相互作用的研究

屈世林 张宇 徐立民 曾玮 刘珂伟 张立群

【摘要】目的：探讨环丝氨酸（CS）与其他二线抗结核药物的体外相互作用。方法：分别选择敏感菌株及同时耐异烟肼利福平的临床分离菌株各 10 株，浓度梯度法测定 CS、莫西沙星（MFX）、卷曲霉素（CM）、对氨基水杨酸（PAS）和丙硫异烟胺（PTO）的最低抑菌浓度（MIC）值，通过计算分级抑菌浓度指数，观察环丝氨酸与其他抗结核药物联合使用时是否存在相互作用。结果：CS 联合 CM、CS 联合 PAS 能检测到协同作用；CS 联合 MFX、CS 联合 PTO 未检测到相互作用。CS 与 4 种抗结核药的分级抑菌浓度指数在敏感和耐多药（MDR）菌株间的差异无统计学意义（P>O.05）。结论：敏感及MDR结核分枝杆菌临床分离株的体外研究结果显示 CS 与 CM 和 PAS 有协同效应，与 MFX 和 PTO 无相互作用。

【关键词】环丝氨酸；微量稀释棋盘法；协同作用；体外研究

【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）06-0251-02

基金项目：2017北京结核病诊疗技术创新联盟CTCTC科研项目基金支持项目（2017KYJJ005）

结核病是严重的全球公共卫生问题，耐药结核分枝杆菌的出现是造成结核病疫情居高不下的重要原因之一。WHO多次发布耐药结核病的诊治指南，其中CS因其口服吸收良好、体内分布广泛、不易产生耐药且与其他抗结核药物无交叉耐药性，在2018年指南更新中将CS作为耐药结核病治疗方案的B组药物，常与其他抗结核药物联合应用。本研究通过测定CS对敏感及MTB临床分离株的体外抑菌作用，探讨CS与其他抗结核药物联用时的体外相互作用，为临床合理使用CS提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验用菌株：选择荆州市胸科医院细菌室保存的标准菌株H37Rv菌株1株，经绝对浓度法药敏试验确定为敏感的临床分离菌株10株、同时耐异烟肼（H）和利福平（R）的临床分离菌株10株。敏感菌株10株均为临床初治结核病患者菌株，耐药菌株10株，其中初始耐药患者2例，其余8例均为临床复治患者，其中使用左氧氟沙星大于1月者3例，使用阿米卡星大于1月者2例，均未使用莫西沙星（MFX）、丙硫异烟胺（PTO）、对氨基水杨酸钠（PAS）及卷曲霉素（CM）。

主要药物和试剂：CS、MFX、CM、PTO、PAS均购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 浓度梯度法测定几种抗结核药物的MIC

配制CS，MFX，CM，PAS， PTO， 使药物的储存浓度为320 μg/mL。将药物稀释于10 %OADC 7H9培养基，使其终浓度分别为0.015 μg/mL、0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.125 μg/ mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/ mL、8 μg/mL、16 μg/mL。将20 μL的含药培养基加入96孔板中并在无菌安全柜中风干后待用。

取适量对数生长期的菌株，磨菌后用生理盐水比浊至1个麦氏单位（约107 cfu/mL），用7H9培养液1∶100稀释，使菌液浓度为105 cfu/mL。取稀释后的菌液200 μg/mL孔加入96孔板中，同时设置100 %、10 %、1 %菌量生长阳性对照孔，封板装入自封塑料袋后置 37 ℃温箱培养。以接种当天为第0天，前3天观察培养板状态是否有肉眼可见菌落生长。如果出現浑浊或沉淀需要进行鉴定，以确认是否发生污染。从第7天、10天、14天分别观察培养板上菌落生长情况并记录结果。以孔底出现肉眼可见的白色菌体沉淀为阳性。 MIC定义为孔底可见菌体沉淀小于10%对照孔的最低药物浓度。

1.2.2 观察CS与其他抗结核药物联用的体外相互作用

选取标准菌株H37Rv 1株、敏感临床分离菌株10株、同时耐HR的临床分离菌株10株，微量棋盘稀释法测定CS与其他二线抗结核药物的体外相互作用。将CS的1/4倍、1/2倍、1.0倍、2.0倍MIC浓度分别与MFX、PAS、CM、PTO 的1/4倍、1/2倍、1.0倍、2.0倍MIC浓度联合应用，检测方法同上，观察各种联合用药作用下细菌的生长情况。

计算分级抑菌浓度指数（Fraction inhibition concentration index，FICI）计算公式为：浓度指数（FICI）=联合药敏时甲药MIC/单独药敏时甲药MlC+联合药敏时乙药MIC/单独药敏时乙药MlC，FICI≤0.5为协同；0.54为拮抗。

1.2.3 MIC测定的质量控制

每株菌重复实验3次，最终取3次一致性最好的数值；每次进行操作时，均设H37Rv 标准菌株作为质控株。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 13.0软件分析，CS对H37Rv、敏感和耐多药菌株的MIC比较采用非参数秩和检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浓度梯度法分别测定

标准菌株（H37Rv）、10株敏感菌株及10株耐HR菌株的CS、MFX、PAS、PTO、CM的MIC值，得到3组细菌的MIC值基本一致，分别为CS 2.0 μg/mL、MFX 0.03 μg/mL、CM 1.0μg/mL、PTO 0.125 μg/mL、PAS 0.06 μg/mL。

2.2 CS与其他抗结核药物联用对敏感和耐多药菌株的体外相互作用

在耐多药菌株中，1/4倍MIC浓度的CS与MIC浓度的MFX、PTO联合时可达到90 %以上的抑菌效果；而与1/2倍MIC浓度的CM、PAS联合时亦可达到90%以上的抑菌效果；而1/2倍MIC浓度的CS与1/2倍浓度的MFX联合时可达到90 %以上的抑菌效果，与其他三种药物均在1/4倍MIC浓度联合时可达到90 %以上的抑菌效果（见图1～4）。FICI（Cs+Mfx）=1.25、FICI（Cs+Cm）=0.75、FICI（Cs+PAS）=0.75、FICI（Cs+Pto）=1.25，提示CS与CM、PAS有协同效应，与MFX、PTO无相互作用。敏感菌株与耐药菌株的结果一致。

3 讨论

WHO于2018年推荐环丝氨酸作为治疗MDR-TB的二线核心口服抗结核药之一[1]。其抗菌作用机制是抑制细菌细胞壁粘肽的合成，从而使细胞壁缺损导致细菌耐酸能力减弱，起到杀菌和抑菌作用[2-3]，且与其他药物无交叉耐药。近年来，国内外含环丝氨酸治疗方案对MDR-TB患者的治愈率为66 %～77 %，死亡率和复发率较低[4-5]。

CS最低抑菌浓度为25 mg/L。Deshpande[6]等学者通过结核中空纤维系统模型（the hollow fibersystem model of tuberculosis，HFS-TB）研究CS的药物动力学，发现高浓度CS的杀菌作用与一线抗结核药物及氟喹诺酮类药物相当，提示CS并不是传统意义上的抑菌药物，高浓度环丝氨酸具有杀菌效果，但由于CS的神经精神副反应严重[7]，限制了该药的使用剂量。虽然WHO推荐CS血药浓度为25μg/ ml～30μg/ml是有效安全的，但临床研究发现CS低血清浓度使用率达到44%[8]，大多数患者环丝氨酸的血药浓度只能达到15μg/ml～20μg/ml。Seung等报道中低浓度CS使用率为71.2 %，且与对照组相比，CS低血清浓度使用并不影响患者2月末痰菌转阴率，提示CS与其他抗结核药物可能存在相互作用，从而加强了联合用药的效果。环丝氨酸与异烟肼合并用药有轻度协同作用，但是针对目前异烟肼、利福平等一线抗结核药物的耐药日益严重的情况，急需寻找其他适合与环丝氨酸联合使用且能产生协同效应的抗结核药物。2018年WHO耐多药结核病指南将注射剂及PAS由于不良反应被推荐停止使用。但在我国，由于抗结核新药尚不能广泛应用，而其他药物高昂的价格亦限制了患者能够全疗程的应用，因此，从我国国情出发，现阶段完全剔除注射剂及PAS可能是不明智的。所以，从二线药物中寻找与环丝氨酸有协同作用的抗结核药，并摸索合适的联合用药剂量显得尤为重要。本课题对CS，CM，PAS，PTO之间的相互作用进行了研究，期望能够指导临床，在密切监测不良反应的同时合理用药，明确药物之间相互作用，这对于提高MDR患者的治愈率有重要意义。

有研究表示，环丝氨酸与异烟肼合并用药有轻度协同作用，但是针对耐药率日益严重的情况，急需寻找适合与环丝氨酸联合使用且能产生协同效应的抗结核药物。本次研究结果显示，CS与CM及PAS联合使用的FICI值均为0.75，提示CS与CM及PAS存在协同作用，这或许能够解释在CS中低浓度使用的MDR患者临床治疗方案中，仍然能够取得较满意的疗效的原因，可能是因为方案中同时存在注射剂CM和PAS。但是MDR患者中CS联合CM及PAS的治疗方案与不含CM及PAS的治疗方案的疗效是否存在差异还有待进一步研究。

此外，环丝氨酸作为核心抗结核口服药物，具有独特的结构及作用机制，治疗耐药结核病的前景广阔，但其耐药现象不容忽视，应深入研究其耐药机制以减少耐药的发生。

参考文献

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2018[R].Geneva：World Health Organization，2018.

[2] 宋艷华，郭少晨，高孟秋，等.环丝氨酸治疗耐多药结核病的血药浓度及不良反应监测[J].中国防痨杂志， 2014，36（5）： 399-401.

[3] Halouska SM，Fenton RJ，Zinniel DK，et al.Metabolomics analysis identifies d-Alanine-d-Alanine ligase as the primary lethal target of d-Cycloserine in mycobacteria[J].J Proteome Res，2014，13（2）：1065-76.

[4] 李杨，王飞，吴刑敏，等.环丝氨酸在耐多药结核病化学治疗中应用价值的探讨[J].中国防痨杂志，2018，40（2）：168-172.

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[6] Deshpande D，Alffenaar JC，Kser CU，et al.d-CycloserinePharmacokinetics/ Pharmacodynamics，Susceptibility， and Dosing Implications in Multidrugresistant Tuberculosis： A Faustian Deal[J].Clin Infect Dis，2018.67（3）：308-316.

[7] 王敬，荆玮，陈维，等.含环丝氨酸方案治疗耐多药肺结核患者发生不良反应的临床分析[J].中国防痨杂志，2018，40（8）：810-814.

[8] Lee SH，Seo KA，Lee YM，et al.Low Serum Concentrations of Moxifloxacin，Prothionamide，and Cycloserine on Sputum Conversion in Multi-Drug Resistant TB[J].Yonsei Med J，2015.56（4）：961-7.