黄瓜COP9信号复合体亚基CsCSN5b的亚细胞定位和表达分析

缪倩 任春梅 季英华 杨柳 程兆榜

关键词： COP9信号复合体;黄瓜;亚细胞定位

中图分类号： S642.2   文献标识码： A   文章编号： 1000-4440（2021）04-1084-05

Subcellular location and expression analysis of subunit CsCSN5b from COP9 signaling complex in Cucumis sativus L.

MIAO Qian， REN Chun-mei， JI Ying-hua， YANG Liu， CHENG Zhao-bang

（Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base Co-constructed by Province and Ministry， Nanjing 210014，China）

Key words： COP9 signaling complex;Cucumis sativus L.;subcellular location

江蘇农业学报 2021年第37卷第4期

缪 倩等：黄瓜COP9信号复合体亚基CsCSN5b的亚细胞定位和表达分析

COP9信号复合体（Constitutively photomorphogennic signalosome， CSN）是一种在黑暗条件下抑制光形态建成的调节蛋白[1]，1992年在研究调控拟南芥的光形态建成的转录因子时被发现，突变体拟南芥在黑暗条件下，子叶展开，下胚轴缩短，这一表型与野生型拟南芥在光照下幼苗生长的形态一致。CSN是一种高度保守的多亚基蛋白质复合体，调控动物、植物的生命活动，如生长、分化、繁殖。CSN主要参与调节泛素-蛋白酶体通路（Ubiquitin proteasome system， UPS）[2]，UPS是蛋白质高效特异性降解的主要途径，目标蛋白被泛素三酶级联反应，靶蛋白进行泛素化修饰后，由26S蛋白酶体催化蛋白质降解[3]。其中SCF型泛素连接酶（CRLs）是泛素连接酶E3中最大的家族，该复合体包括Cullin蛋白、RING蛋白、调控蛋白以及底物识别蛋白[4]，CSN可以催化泛素类蛋白NEDD8从Cullin-RING泛素连接酶上去Nedd化导致CRLs活性丧失，实现CSN影响蛋白质降解过程[5]。在高等真核生物中典型的CSN蛋白由8个不同亚基组成（CSN1～CSN8），这些亚基通常含有2个保守结构域：MPN（MPRI-PADI-N-terminal domain）和PCI（Proteasome COP9 signalosome initiation factor 3 domain）[6]。MPN结构域是由3条α螺旋和9条β线缠绕成β片层组成，一般存在于CSN5和CSN6中，主要识别信号因子，激活下游活动，调控生物学功能[6]。PCI结构域存在于CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN7和CSN8中，是复合体亚基装配完整的关键部分，并介导蛋白质的相互作用[7]。

COP9信号复合体亚基已经从多种生物中被克隆并分析，各个亚基的功能也陆续被发现，如水稻OsCSN5B基因[8]、苹果MdCSNs基因[9]、甘蓝型油菜BnCOP9基因[10]、菊花CmCSN1基因[11]，拟南芥CSN蛋白[12]，烟草CSN4蛋白[13]等。CSN5结构最为特殊，它具备完整的催化活性位点和金属离子锌结合位点，在生物体中以单体或小复合体的形式发挥功能[14]，有研究结果表明人体内的同源基因Jab1与癌症密切相关[15-17]。CSN5可调控真菌生长发育和代谢，茶树内生真菌无花果拟盘多毛孢基因组中找到的同源基因PfcsnE，是分生孢子形成的必需条件，并调控菌株的次级代谢活动[18]。CSN5在植物逆境胁迫中扮演重要角色，双生病毒编码的C2蛋白能够与拟南芥的CSN5A互作，影响拟南芥泛素化蛋白质降解[19]。拟南芥突变体csn5对盐表现出较高的耐受性，发现CSN5B通过26S蛋白酶体途径降解GDP-甘露糖焦磷酸化酶，影响植物抵御非生物胁迫的关键因子抗坏血酸（AsA）的合成，CSN5B功能缺失后AsA的含量升高，处于较高水平，可提高植物对环境胁迫的耐受性[20]。CSN5有2个编码基因CSN5a和CSN5B，现在研究较多的是CSN5a的功能。

黄瓜是瓜类蔬菜作物中具有重要经济价值的一类，全国范围内收集的3 283份黄瓜疑似病毒病样品中，黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）检出率为21.38%。CGMMV发展形势日趋严峻，严重影响黄瓜的品质和产量，使黄瓜产业经济损失达15%～25%[21]。本研究首次从黄瓜中克隆到CsCSN5b，前期研究预测CsCSN5b与CGMMV的CP蛋白有互作关系，猜测CsCSN5b在黄瓜应答CGMMV生物胁迫中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试CGMMV毒源为本实验室保存的2012年采集于海南的具有典型发病症状的西瓜样品上[22];植物材料黄瓜9930（Cucumis sativus L.）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）由本实验室保存;荧光标记载体35S：YFP由南京农业大学陶小荣实验室提供。

1.2 植物总RNA的提取和cDNA的合成

黄瓜总RNA提取参照RNA提取试剂盒使用说明书操作，总RNA经Nanodrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测后，取5 μg RNA为模板，按TaKaRa反转录试剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书操作得到cDNA，将剩余的RNA和cDNA于-80 ℃保存，用于后续试验。

1.3 CsCSN5b基因克隆及其序列分析

根据公开的黄瓜基因组信息，设计CsCSN5b基因扩增引物COP9-bf：5′-CGGGATCCATGGAGCCGTTTCCATCATC-3′和COP9_bR_dTGA：5′-CGGGATCCGCTTTCCACCATTGGTTCTG-3′（下划线为引入的Bam H Ⅰ酶切位点），以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，32个循环;72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。纯化产物与pMD18-T载体连接，连接体系参照pMD18-T载体试剂盒说明书操作，16 ℃连接过夜，连接产物通过热激法转化大肠杆菌感受态TOP10，挑取单菌落PCR鉴定得到阳性克隆，送于南京金斯瑞生物公司进行测序。利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast在线分析工具进行序列分析，使用MEGA6软件的临接法（Neighbor-joining）构建系统进化树，进化树的可信度使用1 000次自导复制验证。

1.4 CsCSN5b-YFP融合表达载体构建

参照质粒提取试剂盒说明书提取pMD18-CsCSN5b质粒，用Bam H Ⅰ进行单酶切，37 ℃酶切1 h，酶切产物通过T4连接酶连接经Bam H Ⅰ单酶切的线性化35S：YFP，连接体系参照T4 DNA Ligase试剂盒说明书操作，22 ℃连接1 h。连接产物通过热激法转化大肠杆菌感受态TOP10，送于南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

1.5 CsCSN5b蛋白的亚细胞定位观察

重组质粒CsCSN5b-YFP电击法转化农杆菌GV3101，以35S：YFP空载体为对照，在LB平板（含50 mg/L 利福平和50 mg/L硫酸卡那霉素）上筛选培养，经PCR鉴定阳性菌落，用于后续试验。

将转入35S：：CsCSN5b-YFP农杆菌和35S：YFP空载体的农杆菌单菌落用液体LB（含50 mg/L 利福平和50 mg/L硫酸卡那霉素）振荡培养，至OD600约为1.0，离心收集菌体，弃上清液，加入诱导液[150 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MES（pH5.7）和10 mmol/L MgCl2]重悬菌体，室温避光静止2 h，选取4～6叶龄健康本氏烟草的叶片，表皮按压注射菌液。40 h后取浸润区烟草叶片置于载玻片上，于激光共聚焦显微镜（ZEIZZ LSM710）488 nm激发光下观察上表皮细胞中目标蛋白表达情况及其亚细胞定位特征。

细胞核染色采用DAPI标记法。取浸润区烟草叶片置于载玻片上，于激光共聚焦显微镜360～400 nm激发光下观察。

1.6 CsCSN5b蛋白Western blot分析

按照植物蛋白提取试剂盒（Solarbio）说明书提取烟草叶片植物总蛋白质，加入适量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（×5），漩涡震荡混匀，99 ℃金属浴10 min，冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，用于Western blot试验。取20 μl上述蛋白质样品于12% SDS-PAGE胶上进行电泳（80 V，30 min;130 V，1 h）检测，转印硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭，室温60 r/min震荡1 h，然后以1∶5 000的GFP抗体常温孵育，60 r/min震荡1 h，经PBST洗涤4次，用辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔作为二抗1∶5 000常温孵育，60 r/min震荡1 h，用PBST洗涤4次。显色试剂盒ECL Western Blotting Substrate避光显色，在天能Tanon 5200 Multi全自動荧光/化学发光成像分析系统下曝光显影。

1.7 CsCSN5b转录产物的RT-PCR检测

浸润区烟草叶片总RNA提取参照RNA提取试剂盒说明书操作，取5 μg RNA为模板，按TaKaRa反转录试剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书合成cDNA。以cDNA为模板，利用35S：YFP上游引物35SBglⅡ-F和CsCSN5b基因扩增引物COP9_bR_dTGA进行PCR检测，为了验证35S：：CsCSN5b-YFP在本氏烟草叶片细胞中是否正常转录。

1.8 基因表达分析

已感染CGMMV病毒的西瓜叶为接种病原，称0.1 g新鲜病叶，加入10 ml 0.01 mol/L PBS（pH7.0）缓冲液研磨，在10 d苗龄的黄瓜子叶上均匀喷洒少许金刚砂，吸取500 μl接种液滴在子叶上，手指顺着叶脉方向轻轻摩擦叶面，同时以PBS缓冲液接种作为对照组（CK），接种10 min后，对接种的叶片喷洒清水保湿。摩擦接种后第7 d、第15 d和第25 d采集黄瓜叶片。

提取黄瓜叶片样品的RNA，第一条链cDNA链的合成参考PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书，以反转录得到的cDNA为模板，根据克隆得到的黄瓜CsCSN5b基因序列设计荧光定量PCR引物QCsCOP9-F：5′-ACACCTATCTATGGCTGG-3′，QCsCOP9-R：5′-TTGCACCGAGTCGTTCATAGA-3′，以QCsActin为内参基因，进行荧光定量PCR，检测CsCSN5b基因在接种CGMMV后的表达情况。扩增条件为：预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，每组试验设3次生物学重复，采用2-△△Ct法对CsCSN5b基因进行相对定量分析，Ct值为达到检测阈值时的PCR循环数。使用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 黄瓜CsCSN5b基因克隆

提取黄瓜叶片总RNA，反转录合成cDNA第一条链，以cDNA为模板，利用CsCSN5b全长扩增引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增到1条大小约1.2 kb的特异性条带，与预期的目的基因（1 098 bp）大小基本一致。转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，验证重组质粒pMD18T-CsCSN5b序列准确无误。

2.2 CsCSN5b蛋白的生物信息学分析

黄瓜CsCSN5b基因核苷酸序列全长1 098 bp，编码1个含有365个氨基酸的蛋白质，相对分子质量大小约36 700。利用NCBI Conserved Domain Search分析保守结构域，发现CsCSN5b编码的蛋白质属于COP9信号复合体CSN第5亚基家族，含有典型的MPN保守功能域，并且有1个锌结合位点，很可能与复合体的催化活性有关。MPN同源蛋白进化树分析结果显示，CsCSN5b与葫芦科植物番南瓜（Cucurbita maxima）、中国南瓜（Cucurbita moschata）、西葫芦（Cucurbita pepo）、甜瓜（Cucumis melo）、小黄瓜（Cucumis sativus）CSN5b的氨基酸序列具有较高的同源性，其中与小黄瓜的亲缘关系最近，与荷花（Nelumbo nucifera）、棕榈（Elaeis guineensis）、玉米（Zea mays）的亲缘关系较低。

2.3 CsCSN5b-YFP融合表达载体构建

克隆CsCSN5b基因时在基因的两端加入了BamH Ⅰ酶切位点，因此通过Bam H Ⅰ单酶切pMD18-CsCSN5b获得2条片段，其中一条是pMD18T载体片段，大小约为2 000～3 000 bp，另一条大小约1 200 bp的条带，与预期的1 098 bp CsCSN5b基因片段大小相近。对最终筛选的阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序验证的阳性克隆，序列正确的带有YFP标签的融合表达载体命名为35S：：CsCSN5b-YFP。为了确保插入方向正确，35S：：CsCSN5b-YFP融合表达载体进一步用载体引物35SBglⅡ-F和CsCSN5b基因扩增引物COP9_bR_dTGA进行菌落PCR筛选，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到另一条大小约1 200 bp的条带，与预期的1 098 bp CsCSN5b基因片段大小相近。进一步Bam H Ⅰ酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，有2个条带，其中一条是35S：YFP载体，大小在15 000 bp左右，另一条大小约1 200 bp，与预期的1 098 bp CsCSN5b基因片段大小相近。

2.4 CsCSN5b编码的蛋白质亚细胞定位分析

激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光蛋白在烟草表皮细胞高效瞬时表达，35S：：CsCSN5b-YFP融合蛋白在细胞核和细胞质中均有绿色荧光信号，用DAPI处理发现35S：：CsCSN5b-YFP融合蛋白在表皮细胞的细胞核中有荧光信号，所以可以推测CsCSN5b蛋白的亚细胞定位在细胞核和细胞质中。

2.5 CsCSN5b-YFP的表达检测

浸润CsCSN5b-YFP的烟草叶片可以扩增到1条与CsCSN5b目的片段大小一致的条带，空载体没有出现对应条带，表明重组蛋白转录正常。

提取浸润处烟草叶片植物总蛋白质，进行Western Blotting蛋白质印迹检测，结果显示，63 000处有单一目的条带，与预期的CsCSN5b-YFP融合蛋白大小一致，接种YFP的烟草在27 000处有条带，与预期的YFP大小一致。表明提取的植物蛋白质与抗YFP抗体发生特异性结合，说明构建的融合蛋白成功表达。

2.6 CsCSN5b基因表达分析

荧光定量PCR结果表明，与对照组相比，CGMMV处理的黄瓜叶片中CsCSN5b基因相对表达量随着时间的推移升高，CGMMV处理的第7 d CsCSN5b基因表达量是对照组的1.24倍，第15 d CsCSN5b基因表达量是对照组的1.67倍，第25 d CsCSN5b基因表达量是对照组的5.74倍。说明CsCSN5b基因能够响应CGMMV侵染胁迫，上调表达，该基因可能是CGMMV生物胁迫的反应基因。

3 讨论

CSN首先发现于拟南芥中，相对分子质量为450 000～550 000[23]，后来在人类、果蝇、酵母等生物中相继发现，不同亚基在不同生物体中的功能和数目有较大的差异[24]。CSN主要通过金属蛋白酶活性、去泛素化活性和蛋白激酶活性在生物体内发挥生物学作用[25-27]，参与植物激素信号传导、逆境胁迫应答、次生代谢等活动。N基因是抗烟草花叶病毒（TMV）的典型基因，烟草中证实NbRar1和NbSGT1对N基因介导的抗病毒作用是必需的，采用酵母双杂技术和免疫共沉淀技术发现NbCOP9复合物与这2种基因有联系，利用VIGS技术发现NbCOP9復合体表达水平下降导致N基因介导的TMV抗性下降[28]。双生病毒C2蛋白与CSN5互作，改变CSN复合物的活性，干扰寄主对病毒蛋白泛素化过程。

CSN5比较特别，它参与各种细胞活动的调控，如细胞的增殖和凋亡[29]，单独或以复合体形式存在都可以发挥功能[30]。CSN5的催化中心是Jab1/MPN/Mov34（JAMM）子结构域，它可以调节降解类泛素化酶的活性，为CSN发挥作用提供帮助。2014年发现拟南芥中CSN5是由2个同源基因编码的CSN5a和CSN5b异构体组成，在拟南芥生长过程中突变其中1个基因植物能生长，2个基因同时突变就会产生典型的cop/det/fus突变体致死表型，说明两者行使了部分重叠功能[31]。2011年在CSN5基因沉默突变株中发现茉莉酸的合成量大大降低，水杨酸含量无变化[32];2018年发现拟南芥csn5a缺陷型影响表面毛状体和花青素、苯丙素、类胡萝卜素等化合物的合成，从而改变了TTG1/bHLH/MYB转录复合物的调控协同性[33];2017年在小麦上接种叶锈病病菌发现高抗性的宿主体内TaCSN5转录丰度较高[34]。

黄瓜是瓜类蔬菜作物中具有重要经济价值的一类[35-38]，近年来CGMMV在葫芦科作物上的危害渐趋严重，并已成为危害设施瓜类作物的主要病毒。本研究首次从黄瓜中克隆了COP9信号复合体亚基CsCSN5b基因，该基因ORF全长1 098 bp，编码的蛋白质相对分子质量36 700，该蛋白质含有1个保守的MPN功能域，与CSN5蛋白结构相似，氨基酸序列比对分析结果发现，CsCSN5b与葫芦科植物的CSN亲缘关系较近。本研究构建了带有YFP荧光标签的重组表达载体CsCSN5b-YFP，转化农杆菌后浸润接种烟草，进一步研究其亚细胞定位特征，发现带YFP标签的CsCSN5b蛋白成功在烟草细胞核和细胞质中表达，这是首次在黄瓜中克隆CsCSN5b基因并研究其亚细胞定位特征，为研究其功能提供了基础。在本研究中，CGMMV侵染黄瓜苗后，CsCSN5b基因表达量逐渐上升，说明该基因参与了病毒胁迫的应答机制，响应CGMMV感染胁迫。但是CsCSN5b基因在黄瓜受CGMMV感染后具体表达模式和调控机制尚不明确，需要更深入的探究。

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（责任编辑：陈海霞）

收稿日期：2020-10-23

基金项目：江苏省农业科技自主创新基金项目[CX（19）3108];国家公益性行业科研专项（201303028）;国家自然科学基金项目（31501610）

作者简介：缪 倩（1986-），女，江苏常州人，硕士研究生，主要从事植物病毒研究。（E-mail）：miaoqian603@163.com

通讯作者：程兆榜，（E-mail）onlyone8501@126.com