铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-LasR的构建及在大肠埃希菌中的表达效率

欧兴坤 李文桂

重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所400016

铜绿假单胞菌具有代谢多样性的特点，在环境中广泛分布，是重要的机会致病菌，常导致免疫功能受损患者的多种感染[1-2]。使用抗菌药物是目前防治铜绿假单胞菌感染的主要方法，但铜绿假单胞菌存在多种耐药机制（低外膜渗透性、外排泵、灭活酶和生物膜生成等），还可通过质粒、转座子（Tn）或整合子（In）等可移动基因原件（MGE）来传播药物抗性，其耐药表型也呈现多耐药到泛耐药。有效的疫苗可减少铜绿假单胞菌感染，减缓耐药菌的出现与传播，弥补抗菌药物化疗的不足，是铜绿假单胞菌感染防治的潜在策略之一[3-4]。

LasR蛋白是铜绿假单胞菌群体感应las系统的信号分子受体，与3-氧代十二烷基-高丝氨酸内酯结合，参与铜绿假单胞菌300多个基因的转录调控，这些基因负责铜绿假单胞菌众多毒力因子的产生，包括多种蛋白酶和次级代谢物等[5]，是铜绿假单胞菌疫苗研制的潜在靶点之一[6]。基因工程化改造减毒致病菌或者益生菌研制的活菌载体疫苗可激发宿主的多种免疫应答[7]，对铜绿假单胞菌疫苗研制有重要应用价值。本研究以pGEX-1λT为载体，构建lasR基因的重组质粒，并研究其在原核系统中的表达效率，为研究粪肠球菌介导的铜绿假单胞菌疫苗奠定基础。

材料与方法

一、实验材料

1.菌株与质粒

E.coliBL21（DE3）株、铜绿假单胞菌PA01株、质粒pGEX-1λT、LB培养基以及铜绿假单胞菌感染的小鼠血清由重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所保存。

2.主要试剂

DNA标记物、T4 DNA连接酶、BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶购自Fermentas公司；中分子量蛋白标记物购自北京鼎国兴盛生物技术公司；二氨基联苯胺（DAB）、考马斯亮蓝、细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、感受态细胞制备试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自上海生工公司；HRP标记的羊抗鼠抗体购自北京鼎今生物科技公司。

3.主要仪器

电穿孔仪和高速离心机为Eppendorf公司；PCR仪和凝胶成像分析仪为Bio-Rad公司。

二、lasR基因的扩增与鉴定

设计lasR基因扩增引物，由上海生工合成。P1（上游引物）：5'-GCGGATTC-ATGGCCTTGGTTGACGGTTTTCTTG-3'；P2（下游引物）：5'-GCGAATTCGAGAGTAATAAGACCCAAATTAACGGC-3'，下划线处为酶切位点。提取铜绿假单胞菌PA01株基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增lasR基因，反应条件为：95℃预变性5 min，（95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min）循环30次，72℃延伸10 min。取5.0μL PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

三、重组质粒pGEX-LasR的构建

将lasR基因扩增产物和载体pGEX-1λT分别进行双酶切，酶切反应体系为：PCR产物或质粒pGEX-1λT各取42.0μL，10×Tango Buffer 6.0μL，去离子水9.4μL，分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶各1.3μL，37℃孵育2 h。按PCR纯化试剂盒操作说明，将酶切产物进行纯化，然后按如下体系进行连接反应：lasR基因片段6.0μL、pGEX-1λT 9.0μL，T4 DNA连接酶（10 U/μL）2.0μL，10×T4 Buffer 2.0μL。反应体系置于4℃下连接过夜，水浴（70℃10 min）灭活连接酶。

四、重组质粒pGEX-LasR的电转化

按试剂盒操作说明制备感受态E.coliBL21（DE3），取80.0μL感受态细胞与20.0μL连接产物混匀，冰浴1 min，转移至1.0 mm电穿孔杯中进行电转化，电转化参数为：电压1.2 kV，时间5 ms，转化次数1～5次。电穿孔完毕后加入1.0 mL LB培养基培养1 h（37℃，150转/min，离心半径2.0 cm），然后挑取适量菌液接种于含50μg/mL氨苄青霉素的LB选择平板上培养48 h。在选择平板上挑取单个克隆接种于含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，培养48～72 h（37℃，200转/min，离心半径2.5 cm），提取质粒进行PCR和双酶切鉴定（反应条件同前）。

五、重组质粒pGEX-LasR的诱导表达

将经PCR和双酶切鉴定的重组BL21（pGEXLasR）接种到LB液体培养基（含50μg/mL的氨苄青霉素）中，培养至A600达到0.5～0.8时（37℃，200转/min，离心半径2.5 cm），取少量菌液作为对照，然后加入IPTG（终浓度1 mol/L）进行诱导表达，在诱导时间为1、3、5、7、9、11和13 h分别取1.0 mL菌液，离心收集菌体沉淀煮沸裂解后进行SDSPAGE电泳，采用考马斯亮蓝进行染色后，用凝胶成像仪扫描分析蛋白的表达情况。

六、Western印迹法鉴定表达产物

细菌裂解液经SDS-PAGE电泳后，切下蛋白标记物条带进行考马斯亮蓝染色，其余部分采用半干法（恒流150 mA，2 h）将凝胶蛋白转移至NC膜。转膜结束后用PBS漂洗3次，每次5 min；采用5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h，PBS漂洗（5 min，3次）；加入1∶100稀释的铜绿假单胞菌感染的小鼠血清（100.0μL血清，10.0 mL封闭液），室温孵育2 h，PBS漂洗（5 min，3次）；加入HRP标记的羊抗鼠抗体（10.0μL抗体，10.0 mL封闭液），室温孵育2 h；PBS漂洗（5 min，3次），加入DAB避光显色15 min；取出NC膜与染色后的标记物条带一起成像分析。

结 果

一、lasR基因的扩增与鉴定

以PA01基因组DNA为模板扩增lasR基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现大小约717 bp的条带（如图1），与目的基因相符。

图1 lasR基因PCR扩增产物鉴定

二、重组质粒pGEX-LasR的PCR鉴定

提取重组菌的质粒为模板进行PCR（如图2），扩增出大小约为717 bp的条带，与lasR基因大小相符。

图2 重组质粒pGEX-LasR的PCR鉴定

三、重组质粒pGEX-LasR的双酶切鉴定

重组质粒与空载体分别进行酶切后，酶切产物采用1.2%琼脂糖电泳进行检测（如图3），重组质粒出现大小约4 947 bp的载体条带和717 bp的lasR基因条带，而空载体无717 bp的条带。

四、表达产物的SDS-PAGE分析

取未诱导以及不同时间诱导的细菌裂解后进行SDS-PAGE分析，结果如图4，经IPTG诱导后出现相对分子质量约为53 000的蛋白条带，与重组GST-LasR蛋白理论值大小相符（GST 26 000，LasR 27 000）。凝胶成像仪分析显示在诱导3～5 h表达量较高，最高可达21%。

图4 重组BL21表达产物的SDS-PAGE分析

五、重组蛋白的Western印迹试验鉴定

以铜绿假单胞菌感染的小鼠血清作为一抗进行Western印迹试验检测，结果如图5，发现该血清可特异性识别经IPTG诱导的重组菌所表达的分子量约为53 000的蛋白条带，未诱导组无此条带。

图5 重组BL21表达产物的Western印迹试验鉴定

讨 论

铜绿假单胞菌是一种耐药问题较为严重的常见机会性致病菌，采用疫苗防治其感染是具有极高应用价值的科学手段之一，但目前铜绿假单胞菌疫苗的研制仍面临巨大挑战[8]。本课题组构建了屎肠球菌介导的铜绿假单胞菌疫苗[9]，它可刺激宿主的免疫系统产生对目标病原体的保护力，其优势在于：（1）载体本身可发挥免疫佐剂的作用；（2）改进抗原的递送途径；（3）能够刺激宿主的多种免疫应答，包括细胞免疫、体液免疫以及黏膜免疫；（4）通过与病原菌竞争，抑制感染的发生与发展[10]。Drolia等[11]以干酪乳杆菌ATCC334株为载体表达非致病性李斯特菌的黏附蛋白（LAP），发现工程菌可在肠内定植，减少单核细胞增生李斯特菌的黏膜定植和全身播散，并保护小鼠免受致命感染，还能募集FOXP3+T细胞、CD11c+DC和NK细胞来增加肠道免疫调节功能。

LasR是LuxR调控蛋白家族的成员之一，由716 bp的开放阅读框编码，相对分子质量大小约27 000[12]。LasR包含两个功能结构域：一个N端的信号分子结合结构域和一个C端的含有螺旋-转角-螺旋（HTH）结构的DNA结合结构域。LasR的N端可折叠形成疏水区，其中Tyr-56、Trp-60、Asp-73和Ser-129残基呈现高度保守，与信号分子相互作用可形成二聚体。LasR二聚体提供了2个HTH基序，以更高的亲和力与启动子结合产生稳定的调控作用，从而促进碱性蛋白酶、弹性蛋白酶和外毒素A等毒力因子的产生[13-14]。研究发现在没有信号分子的大肠埃希菌中，转入lasR基因也可表达出具有活性的LasR蛋白[15]。在感染过程中，多种因素可刺激lasR的高水平表达，包括铜绿假单胞菌的种群密度、碳限制、铁浓度和氧化应激等[16-17]。本研究以铜绿假单胞菌PA01株DNA为模板成功扩增出了717 bp的lasR基因，为构建重组pGEX-LasR提供了条件。

通过重组质粒表达外源蛋白是活菌工程疫苗的重要技术手段之一，具有易于制备和表达效率高的特点。本研究所使用的pGEX-1λT是一种穿梭质粒，含有pBR322复制起始序列和tac强启动子，在细胞内拷贝数较高，是一种表达外源蛋白的高效载体。梁诚诚和李文桂[18]以pGEX-1λT为载体，构建了铜绿假单胞菌的外膜蛋白OprF/OprI融合基因的重组质粒，电穿孔转化两歧双歧杆菌，经IPTG诱导可高效表达具有免疫反应性的OprF-I融合蛋白，在诱导3～5 d表达量可达菌体总量的18%。pGEX-1λT包含lacI阻遏基因、氨苄青霉素抗性基因和多克隆位点（MCS），在MCS上游含有促进外源基因表达的SD序列和谷胱甘肽巯基转移酶（GST）编码序列。GST可增加重组蛋白的可溶性，并且保持蛋白质的生物活性，广泛应用于蛋白质的纯化与功能研究。谢轶等[6]构建的重组质粒lasR-pGEX4T-1在大肠埃希菌中诱导表达，纯化获得GST-LasR蛋白，用该重组蛋白免疫BALB/c鼠，在免疫后两周可检测到特异性抗体，组织病理学检查显示免疫组小鼠肺部炎症反应显著减轻，并且降低了肺组织的细菌负荷，提示GST-LasR可刺激小鼠免疫系统产生对铜绿假单胞菌的抵抗力。本研究以pGEX-1λT为载体，构建了pGEX-LasR重组质粒，以电穿孔的方式转入大肠埃希菌BL21（DE3）感受态，IPTG诱导可表达出相对分子质量大小约为53 000的GST-LasR融合蛋白，该融合蛋白可与铜绿假单胞菌感染的鼠血清发生特异反应，SDS-PAGE显示在诱导第3～5小时表达较高，最高可达菌体总量的21%。

综上所述，本研究成功构建了lasR基因的原核表达载体pGEX-LasR，该重组质粒能在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达具有免疫反应性的LasR重组蛋白，为铜绿假单胞菌疫苗的研制打下了基础。但本研究只采用Western印迹试验初步检测了LasR重组蛋白的免疫原性，其在动物模型中的免疫保护效果和重组蛋白的表达效率等均有待进一步研究和优化提高。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突