L-精氨酸对IPEC-J2细胞β-防御素和PR39基因表达的影响
2021-09-17孙健高敏李璟郑宇
孙 健 高 敏 李 璟 郑 宇
1.北京农业职业学院牧医系，北京102442；2.中国农业大学动物医学院，北京100083；3.北京市房山区新农村建设服务中心，北京102440
抗生素在防治仔猪断奶应激及消化系统疾病方面发挥了重要作用，但抗生素的不当使用和滥用也引起了病原菌耐药、兽药残留和环境污染等问题。为了消除抗生素滥用带来的系列问题，国家实施了饲料端“禁抗”、养殖端“限抗”的政策，因此，在生产实践中寻找抗生素替代品已变得极为迫切。
抗菌肽，又称为宿主防御肽，可保护肠道免受外来病原体的侵袭，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用，由于其具有抗菌谱广、不易产生耐药性等特点，被认为是“替抗”或“减抗”的希望[1]。但由于生产成本及技术方面的原因，抗菌肽尚不能大规模生产。精氨酸作为一种半必需氨基酸，在维持肠道物理屏障功能、缓解氧化应激损伤和增强免疫方面具有重要作用[2]。有研究[3-4]表明，氨基酸、益生菌、维生素和多糖类等日粮中的营养成分可不同程度诱导抗菌肽的表达，但精氨酸作为抗菌肽诱导剂诱导猪肠道抗菌肽表达的研究尚不多见。因此，本试验拟通过细胞试验验证精氨酸对抗菌肽表达的诱导作用，研究精氨酸对抗菌肽β-防御素-1（pBD1）、β-防御素-2（pBD2）和β-防御素-3（pBD3）和PR39 基因表达的影响，旨在为抗菌肽进一步用于生产实践提供参考。
1 材料与方法
1.1 材 料
1）主要试剂。IPEC-J2 细胞由农业农村部饲料工业中心惠赠；DEM/F12 培养基、胎牛血清、L-精氨酸、胰酶溶液，购自美国Gibco 公司；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒购自北京天根生物科技公司；荧光定量试剂盒，购自北京康为世纪科技有限公司（CW0957M）。
2）主要设备。二氧化碳培养箱，购自美国Ther⁃mo 公司；超净工作台，购自江苏安泰空气技术有限公司；倒置显微镜，购自日本Nikon 公司；PCR 仪，购自美国BIO-RAD 公司；荧光定量PCR 仪，购自美国罗氏公司。
1.2 方 法
1）IPEC-J2 细胞培养与精氨酸添加。IPEC-J2细胞铺满6 孔板底层80%时用于试验，分为试验组和对照组，对照组细胞不做任何处理，试验组细胞培养至细胞铺满底层80%时更换培养基，添加精氨酸，使培养基内L-精氨酸的终质量浓度分别为200、100、50 µg/mL，每个浓度设3 个重复孔，继续培养24 h，收集细胞。
2）细胞总RNA 的提取与反转录。严格按总RNA 提取试剂盒说明书操作，用Nano Drop 测定RNA 纯度和浓度，样品A260nm/A280nm比值为1.8～2.0，保存备用。用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量。电泳条带清晰者，按照反转录试剂盒说明书进行反转录，得到cDNA，-20 ℃保存备用。
3）PCR 引物设计与合成。参照GenBank 中所提供的基因序列设计特异性引物，内参为GAPDH，目的基因与内参基因引物由公司合成（表1）。
表1 目的基因与内参基因引物序列
4）荧光定量PCR 检测pBD1、pBD2、pBD3 和PR39 基因mRNA 表达水平。用荧光定量PCR 仪检测对照组和试验组pBD1、pBD2、pBD3 和PR39 基因表达水平，采用20µL体系（表2），反应条件：95 ℃预变性10 min，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40个循环，每个样品设3个重复。
表2 荧光量PCR反应体系
5）数据处理。按照基因的相对表达水平＝2-△△CT，计算对照组与试验组相对表达水平，采用GraphPad Prism 8分析做图。
2 结果与分析
2.1 不同浓度精氨酸对β-防御素-1表达的影响
200、100、50µg/mL 3 个质量浓度精氨酸均可促进pBD1 的表达，并呈现先上升后下降的趋势（图1）。
图1 不同浓度精氨酸对pBD-1表达的影响
2.2 不同浓度精氨酸对β-防御素-2表达的影响
200、100、50µg/mL 3 个质量浓度精氨酸均可促进β-防御素-2的表达，并且与培养基中添加精氨酸的浓度呈正相关（图2）。
图2 不同浓度精氨酸对pBD-2表达的影响
2.3 不同浓度精氨酸对β-防御素3表达的影响
200、100、50µg/mL 3 个质量浓度精氨酸均可促进pBD3的表达，中质量浓度的精氨酸对pBD3的表达的诱导作用最强（图3）。
图3 不同浓度精氨酸对pBD-3表达的影响
2.4 不同浓度精氨酸对PR39表达的影响
200、100、50µg/mL 3 个质量浓度的精氨酸对PR-39表达的调控作用不明显（图4）。
图4 不同浓度精氨酸对PR39表达的影响
3 讨 论
β-防御素在肠道疾病发生过程中发挥了重要作用，其水平的降低或功能障碍有可能导致炎症性肠病。从本试验结果来看，L-精氨酸对IPEC-J2细胞β防御素基因的表达具有明显诱导作用，而且调控作用与精氨酸的浓度呈一定的相关性，尤其是β-防御素-2的表达受L-精氨酸的调控作用更为明显。Han等[5]研究发现，结肠炎模型小鼠日粮中添加猪β-防御素-2可降低炎症因子的产生，提高紧密连接蛋白、黏蛋白转录水平，减轻炎症反应。从本试验结果来看，通过日粮营养物质可以调控内源抗菌肽的表达水平，该方法或许是防治炎症性肠病的策略之一[6]。
精氨酸对IPEC-J2 细胞β 防御素基因表达的调控作用要比PR39明显，这说明不同抗菌肽基因对内源性物质的调控敏感性存在差异，其机理和作用途径也存在显著差异。Lan 等[6]研究发现，精氨酸可通过诱导防御素的表达来缓解LPS 诱导的炎症性肠病，其作用途径可能与精氨酸激活mTOR 有关[6]，但其作用机理尚需进一步研究。
