1株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及产蛋鸭发病模型的建立

姚 蓉 康 超 邹 忠 徐巧霞 孙小美 孙小云 金梅林,

1.武汉科前生物股份有限公司，武汉430070；2.华中农业大学动物医学院，武汉430070

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（duck tem⁃busu virus，DTMUV）感染鸭引起的，是2010年以来在我国主要蛋鸭养殖区陆续暴发的一种急性传染病，以蛋鸭、种鸭产蛋骤然下降为主要临床特征，以出血性卵巢炎为主要病变特征［1］。商品肉鸭和育成期的种鸭可在20日龄前发病，表现为神经症状，腿脚麻痹、站立不稳，病鸭大多数因饮水、采食困难衰竭死亡，若发生细菌继发感染则死淘率会增加［2］。鸭坦布苏病毒病的暴发流行给我国养鸭业造成了重大经济损失，严重危害了我国养鸭业的健康发展［3-5］。加强对DTMUV的分离鉴定及发病模型的建立，不仅能对该病进行监测及防控，也能为鸭坦布苏病毒病疫苗的研制和疫苗的效力检验提供实验依据［6-7］。

本研究室采集了湖北某鸭场蛋鸭的卵巢病变组织，组织经研磨处理后，经RT-PCR 鉴定，结果为鸭坦布苏病毒阳性。将组织处理液在SPF鸡胚上连续传代，成功分离鉴定出1 株DTMUV，命名为DT⁃MUV-DF2 株。通过将DTMUV-DF2 株感染成年鸭建立动物感染模型，结果病毒感染1～3 d，有感染鸭血清中病毒分离率均为100%；病毒感染后卵泡出现变形、破裂或出血等变化，感染后5～10 d 卵巢病变率较高，8～10 d 病变率均为100%。对以上统计数据进行分析，最终确定了该病毒对产蛋鸭的发病模型。

1 材料与方法

1.1 鸡胚与试验动物

6日龄SPF 鸡胚和8～10日龄SPF 鸡胚均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

25～40周龄鸭坦布病毒抗体阴性健康易感麻鸭购自湖北隆兴湖蛋鸭养殖股份有限公司。

1.2 主要试剂

病毒基因组提取试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；AMV 反转录酶、RNase Inhibitor 和DNA Marker DL-2000 均购自宝生物工程（大连）有限公司；dNTP Mixture 购自罗氏公司；TransTaq -T DNA Polymerase 购自全式金生物；青链霉素混合液（100×）购自吉诺生物医药技术有限公司；GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自上海生工生物技术有限公司。鸭坦布苏病毒的鉴定引物序列为NS5-F:5´-GGGGAGGTG⁃GTTTGGTTAG-3´；NS5-R:5´-GTTCTGGGGCTTTG⁃GTATC-3´，扩增片段大小为498bp［8-9］。

1.3 样品的采集和处理

无菌采集病死鸭病变卵巢，剪碎匀浆后按1∶4（v/v）的比例加入灭菌磷酸盐缓冲液（PBS），反复冻融3 次后，12 000 r/min 离心5 min，取上清加入青链霉素，使终浓度均为10 000 单位/mL，4 ℃作用2 h。用0.22µm的滤器过滤除菌，滤过液置-70 ℃以下保存备用［10］。

1.4 样品的RT-PCR鉴定

取经处理的病料滤过液300µL 至1.5 mL EP 管中，参照病毒基因组提取试剂盒提取病毒RNA，最后用20 µL DEPC 水溶解。反转录按AMV Reverse Transcriptase说明书进行。PCR反应体系cDNA 2µL，10×Trans Buffer 2.5 µL，TransTaq DNA Polymerase 0.5µL，上、下游引物各1µL，补H2O 至25µL。PCR反应程序为95 ℃变性5 min 后进行94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s 的30 个循环；最后72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃。PCR 产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增出498 bp 片段大小则说明RT-PCR扩增结果为阳性［10］。

1.5 病毒分离

将RT-PCR检测为阳性的病料悬液经尿囊腔接种5 枚8日龄SPF 鸡胚，0.2 mL/胚，每日观察，弃去24 h 内死亡胚，24～96 h 死亡鸡胚随时收获，96 h 后将未死亡鸡胚置4 ℃，且于12 h后收集鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚尿囊液进行RT-PCR 扩增，若为阳性则置-70 ℃以下保存备用，若为阴性则进行盲传，盲传7代后仍为阴性者弃去。

1.6 病毒含量测定（鸡胚半数致死量ELD50）

将病毒悬液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，每个稀释度经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0.1 mL，置湿度60%～65%、温度37 ℃继续孵育。逐日照胚并记录结果，24 h内死亡鸡胚不计，统计24 h后死胚数量，一般需要观察5 d；结果的计算按Reed-Muench法进行计算［11］。

1.7 动物发病模型的研究

1）病毒血症的研究。将25～40周龄成年蛋鸭随机分成10组，10只/组，每只鸭经腿部肌肉接种鸭坦布苏病毒（DF2株）鸡胚毒，每只0.5 mL（病毒含量为105ELD50）。攻毒后第1～10日，每日随机选取一组，经翅静脉采血后分离血清，每份血清卵黄囊接种5枚6日龄SPF鸡胚，每胚0.1 mL。接种后置37 ℃温箱继续孵化，24 h内死亡鸡胚弃去，统计24～120 h鸡胚死亡情况，5枚鸡胚至少有4 枚鸡胚死亡，则判定这份血清病毒分离为阳性［12-13］。

2）卵泡病理变化。每日对采血后的鸭进行剖杀，观察并记录卵泡是否有破裂、出血、变形或坏死等病理变化。统计每日卵泡病变比例，摸索鸭坦布苏病毒引起的卵泡病变规律。结合病毒分离情况及卵巢病变情况，分析卵巢的病变特征，依据病毒分离及卵泡病变情况确定发病判定标准［14］。

2 结果与分析

2.1 病毒分离及鉴定结果

对采集的样品进行RT-PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，从3份样品中扩增出了特异性片段，大小为498 bp，与预期结果相符（图1）。将RT-PCR 检测为阳性的病料悬液经尿囊腔接种5枚8日龄SPF 鸡胚，对收获的鸡胚尿囊液进行RTPCR 扩增，结果在盲传3 代后RT-PCR 扩增为阳性，记为F1代。在鸡胚上连续传代至F5代，RT-PCR扩增均为阳性（图2），将获得的病毒液命名为DF2 株（登录号为KJ489355.1）。

图1 病料RT-PCR扩增结果

图2 分离株RT-PCR扩增结果

2.2 病毒在鸡胚上的传代与含量测定

将获得的DF2 株病毒液在SPF 鸡胚上连续传代，一直到第10 代，结果每一代病毒液的RT-PCR均为阳性，测定各代次病毒液的病毒含量ELD50，结果DF2 株病毒在传到第5 代时病毒滴度上升到104.5ELD50/mL，在第10 代达到105.0ELD50/mL，说明DF2株在鸡胚上的增殖能力较强（表1）。

表1 DF2分离株在SPF鸡胚上的增殖滴度（ELD50/mL）

2.3 动物发病模型结果

1）病毒分离。鸭只经病毒感染后前3 d病毒分离阳性率均为100%，从第4天开始病毒分离阳性率开始下降，自第6 天开始，血清病毒分离均转为阴性（表2）。

表2 感染鸭病毒分离情况

2）卵泡病变情况。鸭只经病毒感染后，每日对已采血的鸭只进行剖杀，结果，有13只鸭无大的卵泡，卵泡直径均＜1 cm，说明卵泡发育处于静止期，无法判断病毒感染对卵泡发育的影响，所以卵巢检查应剔除卵泡发育处于静止期的鸭［14］。其余87 只鸭卵泡处于生长期，病毒感染后第2日卵泡开始出现破裂、变形、出血或坏死，第5～10 天卵泡病变率较高。对第5～10 天的卵泡病变类型进行统计，结果25.5%（14/55）卵泡破裂、96.4%（53/55）卵泡变形、38.2%（21/55）卵泡坏死（图3）。详细结果见表3。

图3 卵泡病变情况

表3 卵泡病变统计情况

3）发病判定标准的确定。由于产蛋母鸭卵巢发育存在个体差异（卵泡大小、卵泡数量），我们在制定发病判定标准时对这些情况进行了区分，以便于更客观的评价感染情况。①存在个别母鸭产蛋暂时处于静止期的生理状态，此时的卵泡直径均小于1 cm，卵泡病变情况不易判断，所以我们在制定卵巢的病变情况时设定了卵泡直径大于1 cm 的判定条件。②当母鸭产蛋旺盛时卵泡数量过多，在试验操作过程中会引起个别卵泡非特异性出血，为了更客观地判定攻毒鸭的发病情况，我们在制定发病判定标准时对此种情况规定为当卵泡数＞3 时，变性和坏死卵泡数≥3 判为卵巢病变。③当母鸭卵泡数偏少时无相应的因挤压等引起的卵泡非特异性出血，我们在制定发病判定标准时对此种情况规定为当卵泡数≤3 时，变性和坏死卵泡数≥1 判为卵巢病变［14］。

综合以上卵泡病变情况以及病毒血症规律，我们确定了鸭坦布苏病毒感染鸭的发病判定标准如下，攻毒后第3日采血分离血清，每份血清卵黄囊接种5枚6日龄SPF 鸡胚，0.1 mL/枚，置37 ℃培养箱培养，持续观察5 d，24 h内死亡鸡胚不计，如接种鸡胚中有4 枚及以上死亡，则判为病毒分离阳性。病变卵巢的判定：卵泡数＞3 个时，变形、出血或坏死卵泡数＞2 个，卵泡数≤3 个时，有变形、出血或坏死卵泡。卵巢发育成熟期的鸭，病毒分离和卵巢病变均为阳性则判发病。

3 讨 论

2010年以来我国大部分种鸭和蛋鸭养殖地区相继发生了以减料、产蛋下降和伴有一定死淘率为特征的传染病，该病发病急，传播快，死淘率高［15］。该病能引起蛋鸭产蛋率骤降、肉鸭发育迟缓甚至死亡，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。自该病暴发以来，迅速蔓延至我国大部分鸭养殖地区以及临近的东南亚地区。DTMUV 宿主范围广泛，除了感染鸭、鹅等水禽和鸡、麻雀等其他禽类外，也可以感染哺乳动物，具有潜在的公共卫生安全风险［16］。

在本研究中，本研究室从疑似感染鸭坦布苏病毒的病鸭组织中分离到1 株鸭坦布苏病毒，在SPF鸡胚上增殖稳定后，对产蛋麻鸭进行了攻毒试验，摸索鸭坦布苏病毒病的发病情况。在此基础之上，我们建立了一种鸭坦布苏病毒病在产蛋鸭上的动物模型，并确定了其发病判定标准，这不仅能在鸭坦布苏病毒病疫苗的研制过程中提供疫苗的效力检验评判标准，也为该病的临床诊断提供了依据，能有效监测和防控鸭坦布苏病毒病的流行和蔓延［17］。