微生物在畜牧业上的筛选应用研究进展

陈 利，苏国旗，黄金秀，周晓容

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

0 引言

微生物在生态系统中主要起着分解者的作用。通过利用现代生物科学技术，了解微生物的新陈代谢路径及中间产物种类，对微生物的新陈代谢过程进行人为调节，才能更好地服务于工业、农业生产。微生物总数达300万种，远大于动植物总数之和[1]，潜在的可开发利用的微生物资源巨大。利用微生物发酵技术可改善饲料营养及适口性、降低饲料毒性、提高可溶性蛋白含量、降低粗纤维含量、增强免疫、提高饲料报酬；提供有益微生物或者代谢产物开发出新型饲料[2-3]。有些微生物发酵产品还能够消除臭味，降解粪污污染，并在病死畜禽无害化处理中具有重要作用，对于持续无污染养殖具有重要意义。

1 畜牧微生物研究方向

微生物种类繁多，而且微生物的基因表达新陈代谢途径存在相互交叉。通过现代科学技术发现微生物发酵代谢过程中存在畜牧产业中能促进生产或者辅助生产的初级、次级代谢产物。比如利用微生物发酵生产酶类、营养活性物质类、香味剂、酸化剂、维生素、氨基酸以及发酵饲料类；利用微生物研发微生物饲料添加剂、微生物粪污以及病死畜禽处理添加剂等。

1.1 酶类开发

利用基因工程的方法可以使酶的表达量提升数个数量级，产业化后，添加至饲料中，对于饲料中难消化或者有毒有害物质，能进行比较充分的降解。对于一些高纤维难于消化吸收的饲料，还可利用酶解加上发酵的方法，提高饲料的营养价值。Grethe等[4]在液体发酵前48 h过程中添加聚葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶的混合酶，能提高菜籽饼和小麦干酒糟的饲料营养价值，这是一种分解非淀粉多糖NSP的方法。其他酶类资源有淀粉酶[5]、纤维素酶[6]等。

1.2 营养活性物质类

潘予琮等[7]提出饲料营养活性物质主要包括多糖类(抗氧化、抗菌作用[8])、黄酮类(抗菌、消肿、解热等作用[9])、酚类(抗氧化、抑菌、调节肠道健康和增加抵抗力等作用[10])和挥发油(又叫植物精油，有增强免疫、抗炎、抑菌等功效[11])等四大类。这些饲料营养活性物质主要存在于植物中，微生物在发酵过程中也会产生。在中草药中对黄酮类、酚类、挥发油等物质的提取多以物理、化学方法，如使用萃取、超声波、微波、水蒸气蒸馏法等。这些方法具有耗时长、生产成本高的缺点，而使用微生物发酵的方法，可以生产出不需要精提取的饲料营养活性物质并可以使畜禽增加相应活性物质的吸收[12]，生产成本低，提高了经济价值。

1.3 小分子促进生长因子

利用微生物能发酵生产香味剂(3-羟基丙酸、甲基戊基甲酮、十五酸乙酯等[13])、酸化剂(柠檬酸等[14])、维生素(VB2、VB12等[15])、氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸等[16-17])、抗菌肽等。香味剂、酸化剂等能促进动物采食量，提高饲料消化率；维生素、氨基酸等能够维持动物的正常生长和繁殖；抗菌肽可调节免疫、抑制病原菌。小分子促进生长因子对于禽畜的健康生长以及经济效益的提高，具有重要作用。

1.4 发酵饲料类

饲料及原料中含有种类众多的抗营养因子以及真菌毒素，如胰蛋白酶抑制因子、抗维生素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A等[18]。抗营养因子和真菌毒素去除和降低的方法分为物理、化学以及生物方法。传统的挤压膨化、氨气熏蒸等物理化学方法都相对剧烈，生物降解方法相对温和，对于饲料原有营养价值、风味影响较小，有些微生物甚至能改善原饲料的适口性以及增加饲料的营养价值[19]。利用微生物把动物不易消化吸收的大分子物质和抗营养物质进行降解转化，形成一种富含益生菌及生物活性成分的生物发酵饲料。这种饲料不仅利于动物的消化吸收，而且改善微生态平衡，抑制或者杀死病原菌，从而提高动物生产力[20]。比如菜籽粕含有硫代葡萄糖苷、单宁等抗营因子，吴正可等[21]筛出一株嗜酸乳杆菌，对硫甙的降解率为39.25%，有效降低了抗营养因子。此外，酵母菌含有动物需要的各种必须氨基酸、蛋白质以及各种矿物质、糖类、维生素等。酵母菌能维持胃肠道微生态平衡，促进益生菌生长，进而提高动物免疫力水平[22]，提高饲料效率[23]。此外，贾金如等[24]在稻草的固态发酵中，利用粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)发酵后，比未经发酵的稻草的真蛋白含量提高了138.19%，饲料营养价值得到有效提升。

1.5 畜牧污染治理类

禽畜粪便在自然堆放过程中会产生H2S、NH3、甲基硫醇等有毒有害气体，堆放位置不当，轻则降低禽畜生产力，重则污染环境。在饲料中添加微生态制剂类除臭剂，可以在源头上防止H2S、NH3的产生[25]。微生物在脱硫、除氨和清除有恶臭气味的芳香族化合物具有重要作用。微生物除臭机理是通过硝化、反硝化以及氧化还原等作用转换H2S、NH3等毒害气体，并调控碳氮代谢，使有机物降解为芳香小分子有机物，减少氮素等挥发，减少臭味气体形成[26]。微生物降解除臭方法无二次污染、效率高并且经济[27]。

在禽畜粪便中残留抗生素的降解方面，有些微生物同样起着重要的作用。孟应宏等[28]从菌肥中筛选到一株高效土霉素降解菌T4假单胞菌 (Pseudomonassp.)，在猪粪中土霉素浓度为 50 mg/kg的堆肥实验中，土霉素的降解率达到了93.21%，能有效降解土霉素的污染。另外，Lin等[29]发现假单胞菌 EC22对浓度为1 mg/L的头孢氨苄24 h的降解率大于90%。抗生素的降解原理是微生物分泌了一种修饰或者水解的酶类导致了抗生素分子结构的破坏[30]。

在治理畜牧污水方面，微生物絮凝剂能起到很好的效果，是无二次污染的水处理剂[31]。微生物絮凝剂包括多糖、糖蛋白、纤维素、蛋白质以及DNA等[32]。猪场污水前处理主要使用聚丙烯酰胺和聚合氯化铝，化学絮凝剂衍生的许多单体对人体有害，如丙烯酰胺[33]和铝离子[34]都与阿尔茨海默氏症相关。微生物絮凝剂具有安全无毒，易于降解的特点。张鲁新等[35]筛选到一株解淀粉芽孢杆菌 FD-14，能产生多糖类生物絮凝剂，对猪场污水絮凝率高达79%，比用化学絮凝剂高16.3%。此外，禽畜粪便难以处理的原因之一是禽畜未消化的纤维素在自然条件下降解过于缓慢。而筛选出的能耐受高温的纤维素降解微生物是降解禽畜粪便中未消化纤维素和研制菌肥菌剂的重要材料[36]。微生物堆肥后，解决了养殖生产的废弃物问题，并且为农作物饲料源提供肥料[37]，实现循环经济。

1.6 病死畜禽无害化处理类

病死禽的处理一直是困扰养殖生产的难题，如果控制不好，极易造成水体和环境的污染[38]。李海龙[39]等从病死猪粉碎发酵锯末堆肥中筛选能高效降解蛋白质的耐受高温菌株芽孢杆菌N-3 (Bacillusaestuarii)和高效降解脂肪的耐受高温菌株嗜热脱氮芽孢杆菌Y-3(Geobacillusthermodenitrificans)，两种菌液等体积混合后，按0.6%的堆肥体积添加到堆肥中，能有效提高堆肥温度，最高达到69℃，能够加快病死猪的降解，有效杀灭病原微生物，达到无害化要求。

2 有开发潜力的微生物资源

2.1 极端环境微生物资源

在南北极和火山等极端条件下，这些环境下的微生物必定有独特的基因组类型、独特的生理代谢路径。对这些微生物进行研究，开发出耐受低温、高温或者耐盐的酶类，比如蛋白酶[40]、糖类降解酶[41]等，这对于开发出新的饲料资源具有重要意义。

2.2 不可培养微生物资源

不可培养是指当前的认知水平或者实验条件下的不可培养。采用传统的分离纯化培养方式，能够培养的微生物占1%左右，由于实验室无法完全模拟自然条件的真实状态，忽略了微生物之间的相互作用，导致了大多数的微生物不可培养[42]。使其可培养的主要措施：①添加适当的电子传递链供受体(土壤中含有大量的未知功能的小分子有机物，Tuan[43]使用土壤浸出液作为培养基筛选出了比使用传统稀释分离纯化方法多115种的未培养微生物)。②采用低营养的培养基或者使用无毒害的琼脂替代物，可以降低对微生物的毒害作用(Yoichi[44]使用葛兰胶代替琼脂，从淡水沉积物筛选微生物，长出的菌落总数是使用琼脂的10倍左右)。③琼脂单独灭菌比混合灭菌提高了沉积物中慢生菌分离总数量的55.56 %[45]；琼脂单独灭菌并延长培养时间，从土壤中筛选微生物，发现20 d生长的菌落总数量是2 d的4倍左右[45]。

3 筛选方法

3.1 稀释涂布法

通过改变物理、化学条件的方法，如改变培养温度、pH值、无机盐浓度和氧气含量，加入筛选化合物抗生素，使用营养缺陷型培养基，进而使用稀释涂布方法得到纯培养物[46]，再结合液体发酵，离心发酵液后用上清液进行检测，如观察抑菌圈、透明圈、显色圈等方法，能够筛选得到目标微生物。这种传统的微生物纯培养的方法能更精确地对微生物的特性、生长代谢、生理或者单个有机体的细胞生物学进行研究。但是存在工作效率低，耗时耗力的问题。对于被检测物质表达量低但具有开发潜力的菌种极有可能存在漏筛的情况。

3.2 宏基因组技术

利用宏基因组技术，构建宏基因组文库，筛选微生物资源中特定酶类资源以及小分子生物活性抗菌物质等，如脂肪酶[47]、抗菌肽类[48]。这种高新技术需要一定工作基础，需要有对比数据库进行比对筛选。在不可培养的微生物种类中，蕴含可以开发利用的微生物资源是丰富的，利用宏基因组技术可以提高筛选效率。

3.3 新的微生物筛选技术

由微流体技术衍生出多种微流体分离纯化技术，如Jiang[49]等利用微流控平板划线分离方法(MSP)进行了高通量筛选(一种简便的微流控条纹板(MSP)在纳升液滴中进行高通量微生物细胞分离和培养的方法)，并筛选出一株能够降解荧蒽的未知芽球菌属，对于筛选抗生素类降解菌是有所启发的。Chen等[50]同样发现皮升级的液滴的微流体是乳酸菌诱变改良的筛选方法，对乳酸菌的生产性能进行了改善。

其他高新技术的微生物筛选方法有膜扩散的培养方法，如分离芯片iChip[51]、中空纤维膜室HFMC等[52]，这些方法使用渗透膜，让营养物质和生长因子扩散到培养基，从而模拟更自然的环境。对于原位培养筛选菌株的扩大培养的培养基配方及培养条件需要深度探索。细胞分选技术，如拉曼激活细胞分选(RACS)[53-54]、活细胞原位荧光杂交(live- FISH)[55]、反向基因组学[56]等，提供了一种以特定的功能或细胞亚群为目的分离筛选方法。然而这些微生物高新筛选技术都需要电子机械、人工智能技术的同步发展与支撑。几种筛选方法各有优缺点，具体如表1所示。

表1 各筛选方法优缺点

4 结语

微生物筛选就是要根据微生物的生长繁殖及新陈代谢特性，并且利用现代化的高新科学筛选技术进行高效率筛选，更好地开发饲料微生物资源，这对于畜牧业发展具有重要意义。但是微生物利用中存在一些需要注意的问题：不同微生物发酵工艺不同，发酵饲料的营养价值略有不同；微生物发酵饲料缺乏科学的饲料营养评价体系；对于不同种类的牲畜适用什么种类的微生物发酵饲料，以及促进生长的机理尚不明确。针对微生物发酵饲料，还要进一步研究不同微生物之间互配或者饲料添加剂与菌体互配促进生产的添加量以及促进生产的机理。

对于筛选出的粪污臭味、病死禽处理类微生物，不仅需要了解单一菌种的作用机理，还需要考虑多种菌种配合使用，研究出合适的混合菌种的发酵工艺，提高粪污臭味、污水治理效果，才能达到更好的治理效果。不管是生产类还是粪污臭味治理类微生物都有必要加深基因组学、蛋白组学以及相关化合物新陈代谢途径的研究，这样才能更好地人为调控新陈代谢途径及产物产量，并服务于生产。