外源甜菜碱处理对南果梨果实贮藏品质的影响

李灿婴 ，侯佳宝 ，张 浪 ，蒋超男 ，葛永红

（1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；2.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013）

0 引言

南果梨是辽宁省极具地方特色的秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim）品种，果实色泽鲜艳，风味宜人，素有“梨中之王”的美称［1-2］。新鲜采收的南果梨果实坚硬，口感较差，缺乏独特的香味，后熟后充分显露出果实的口感、风味和色泽。南果梨成熟时间一般集中于9月上、中旬，常温下贮藏寿命较短，由于水分流失、果肉褐变、果实软化等原因，南果梨果实的品质受到严重影响［3］。低温（0±0.5） ℃贮藏通常用于延长南果梨的货架期，但长期冷藏会降低果实品质并导致冷害症状，如失去特有的风味、果皮和果肉褐变［4］。因此，研究和开发南果梨绿色防腐保鲜技术迫在眉睫。

目前，南果梨果实的贮藏保鲜研究多运用气调、低温、1-甲基环丙烯、二氢茉莉酸丙酯、涂膜保鲜、气调贮藏等方法［5-11］。甜菜碱是一类季胺型生物碱，是植物细胞内最重要的非毒性渗透调节物质之一，对细菌、真菌、藻类、植物、动物和人类等生物的渗透调节起着至关重要的作用，具有稳定生物大分子结构和生物膜系统的完整性、维持细胞渗透平衡、保持蛋白质和代谢酶的活性、缓解氧化胁迫损伤等多种生理功能［12］。研究表明，外源甜菜碱处理能够提高番木瓜、枇杷、桃、黄瓜、西葫芦、山楂等果实的抗冷能力，且抑制冷害的发生与激活体内抗氧化相关酶活性和保护膜完整性有关［13-17］。甜菜碱诱导处理能提高Pichia caribbica对苹果灰霉病的控制效果，提高果实抗氧化酶的活性［18］。此外，甜菜碱处理还能够提高桃果实可溶性固形物、总酚和抗坏血酸含量［19］；有效减轻香椿嫩芽的失重率和腐烂，抑制呼吸强度，同时减缓叶绿素、抗坏血酸和总黄酮含量的损失［20］。已有研究表明，甜菜碱能够提高果实抗冷能力减轻冷害现象［21］，保持果实良好的采后品质。植物在受到胁迫时，通过在细胞质中大量积累甜菜碱来调节渗透压，从而维持细胞的水分平衡［22］。然而，有关采后甜菜碱处理对南果梨果实贮藏品质及果实软化的影响尚未见报道。

本研究以南果梨果实为试材，研究采后不同浓度的甜菜碱处理对果实贮藏品质的影响，同时探讨其对果实果胶物质代谢相关酶活性的影响，以期为甜菜碱在南果梨果实采后贮藏保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南果梨果实采自锦州市北镇市罗罗堡镇，八成熟时采收，然后用纸箱包装（60个/箱），运回实验室，在（20±1）℃，相对湿度30%～40%下贮藏待用。

甜菜碱（纯度98%，山东西亚化学股份有限公司）；果胶（纯度74%，北京索莱宝科技有限公司）；3，5-二硝基水杨酸（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；三（羟甲基）氨基甲烷（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

H1650R型小型冷冻离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；UV-1801型紫外分光光度计（北京北分瑞丽分析仪器集团）；Check Point Ⅱ便携式CO2/O2测定仪（丹麦PBI-Dansensor公司）；LX-A型硬度计（北京沃威科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 甜菜碱处理

挑选大小一致、颜色均匀、无机械损伤和病虫害的南果梨果实，用1%次氯酸钠溶液消毒1 min，清水冲洗后将果实分为4份，3份分别用5、10和 20 mmol/L甜菜碱溶液（含 0.1%Tween 20）浸泡果实10 min，1份用等量蒸馏水（内含0.1%Tween 20）处理并作为对照。室温晾干后分别装入PE塑料袋并置于干净的纸箱中，于20±1 ℃贮藏（30%～40% RH）。

1.3.2 呼吸速率和失重率测定

呼吸速率和失重率的测定参照葛永红等［22］方法并修改。分别于处理后第0、2、4、6、8、10、12 d取甜菜碱和清水处理果实30个，分别称重后放入3个密封袋中常温静置1 h，然后用Check Point Ⅱ便携式CO2/O2测定仪测定剩余O2的体积。呼吸速率用mL O2/（h·kg）表示。将甜菜碱和清水处理南果梨果实第0 d的重量视为原始重量，并于处理后第 2、4、6、8、10、12 d 分别称量两组处理的果实重量，记为每次称重量。

失重率（%）=（原始重量-每次称重量）

×100/原始重量。

根据果实的呼吸速率和失重率的变化差异筛选最佳浓度用于后续研究。

1.3.3 取样

根据上述结果筛选的甜菜碱浓度和清水各处理南果梨果实210个，参照GE等［23］方法并修改。分别于处理后第 0、2、4、6、8、10、12 d，取南果梨果实赤道部位皮下2～5 mm的果肉组织约3.0 g，切成小块后，用液氮快速冷冻，用锡箔纸包好后贮藏在-80 ℃冰箱中待用。每次取样用果实15个。

1.3.4 果肉硬度、可溶性固形物含量和可滴定酸测定

果肉硬度和可溶性固形物含量测定参照曹建康等［24］方法并修改。每次取15个甜菜碱处理和对照果实，削去阴阳面中环部位约1～2 mm的果皮，用LX-A型硬度计进行测定，单位用kg/cm2表示。削取赤道部位阴阳面果实（约1～2 mm厚）的果肉，用阿贝折光仪测定可溶性固形物含量，用%表示。

可滴定酸测定参照陈松江等［25］方法并修改。取处理和对照果肉样品10.0 g，用液氮处理后研磨成粉末并用蒸馏水转移到100 mL容量瓶中，冲洗研钵2～3次，合并匀浆，用蒸馏水定容至刻度并摇匀，静置20 min后过滤。滤液用0.1 mol/L NaOH溶液进行酸碱滴定，记录NaOH的用量。

总酸度（%）=cVK×1 000/m

式中 c——已标定NaOH溶液浓度，mol/L；

V——滴定消耗NaOH溶液体积，mL；

m——南果梨果实样品质量，g；

K——换算为0.067 g/mmol苹果酸的系数。

1.3.5 多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶甲基酯酶（PME）活性

参照杨志敏等［26］方法。反应混合液为1.0 mL醋酸-醋酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH值为5.5）、0.5 mL密度为10g/L的底物（PG底物为多聚半乳糖醛酸，PME底物为果胶），在37 ℃预热5 min后，将0.5 mL酶提取液添加到一个试管中，并将灭活酶溶液加到另一个试管中作为对照。混合摇匀后，在37 ℃的水浴中保温1 min后再加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS），在沸水浴中煮沸5 min，迅速冷却至室温，并通过DNS法在540 nm处测定。以1 mL酶液1 min催化底物产生1 µg半乳糖醛酸为1个酶活力单位（U）。

1.3.6 多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）和果胶甲基反式消除酶（PMTE）活性测定

参照杨志敏等方法。取两个试管，依次加入pH值为9.0，浓度为50 mmol/L的4.0 mL Gly-NaOH 缓冲液、3.0 mmol/L 的 1.0 mL CaCl2、1.0 g/L的300 µL多聚半乳糖醛酸或果胶。在30 ℃预保温5 min，然后加入100 µL酶溶液至试管中，立即测定232 nm处反应混合物的吸光度；加入100 µL酶溶液到另一个试管中，并在30 ℃保温10 min，冷却后在232 nm处测定吸光度。PGTE和PMTE活性以每分钟每克组织在酶促反应下催化底物释放1 µmol不饱和醛酸反应量表示。

1.4 数据处理

所有指标测定进行3次生物学重复试验，数据处理采用SPSS 19.0进行LSD分析（p<0.05），采用Microsoft Excel 2010计算平均值和标准误差并作图。

2 结果与分析

2.1 甜菜碱处理对南果梨果实失重率的影响

由图1可知，随着贮藏时间的延长，不同浓度甜菜碱处理和对照南果梨果实失重率逐渐增大，5、10、20 mmol/L的甜菜碱处理果实的失重率始终低于对照组，其中以5 mmol/L甜菜碱处理果实的失重率最低，在贮藏第4～12 d显著低于对照果实。

图1 不同浓度甜菜碱处理对南果梨果实失重率的影响Fig.1 Effects of post-harvest glycine betaine treatment at different concentrations on the weight loss of Nanguo pears

2.2 甜菜碱处理对南果梨果实呼吸速率的影响

由图2可知，在整个贮藏期间，对照和甜菜碱处理果实呼吸速率整体呈先上升后下降趋势，在贮藏第10 d出现呼吸高峰。10和20 mmol/L甜菜碱处理果实呼吸速率始终高于对照组，5 mmol/L甜菜碱处理果实的呼吸速率在贮藏第8～12 d显著低于对照组，并且呼吸峰值为对照的90%。结合呼吸速率和失重率的变化趋势可知，5 mmol/L甜菜碱处理显著抑制了呼吸速率和失重率的增加，并在一定程度上延缓了果实的衰老。因此，选择5 mmol/L甜菜碱处理进行后续指标的测定。

图2 不同浓度甜菜碱处理对南果梨果实呼吸速率的影响Fig.2 Effects of glycine betaine treatment at different concentrations on the respiration rate of Nanguo pears

2.3 甜菜碱处理对南果梨果肉硬度的影响

果肉硬度是果实主要的品质指标，影响果实的口感。如图3，随着贮藏时间的延长，甜菜碱处理和对照果实果肉硬度均呈逐渐下降的趋势，但甜菜碱处理在贮藏第6～12 d显著延缓了果肉硬度的下降。在贮藏第10 d和12 d，甜菜碱处理果肉硬度分别是对照的1.24倍和1.40倍。

图3 甜菜碱处理对南果梨果肉硬度的影响Fig.3 Effects of glycine betaine treatment on the flesh hardness of Nanguo pears

2.4 甜菜碱处理对南果梨果实可滴定酸的影响

可滴定酸主要是果实中的有机酸，影响果实品质和贮藏性。由图4可知，随着贮藏时间的延长，甜菜碱处理和对照南果梨果实中的可滴定酸总体呈先升后降趋势。在整个贮藏过程中，甜菜碱处理果实中的可滴定酸始终高于对照组，但二者之间没有显著性差异。

图4 甜菜碱处理对南果梨果实可滴定酸的影响Fig.4 Effects of glycine betaine treatment on the titratable acid of Nanguo pears

2.5 甜菜碱处理对南果梨果实可溶性固形物含量的影响

由图5可知，甜菜碱处理和对照组南果梨果实可溶性固形物含量总体呈上升趋势，且变化趋势基本一致。贮藏第0～10 d，对照和甜菜碱处理组果实的可溶性固形物含量上升，在第10 d达到最大，然后开始下降。在整个贮藏期间，甜菜碱处理果实的可溶性固形物含量始终低于对照组，但二者没有显著的差异。

图5 甜菜碱处理对南果梨果实可溶性固形物含量的影响Fig.5 Effects of glycine betaine treatment on the soluble solids content of Nanguo pears

2.6 甜菜碱处理对南果梨果实PME和PG活性的影响

由图6（a）可知，随着贮藏时间的延长，甜菜碱处理和对照果实PME活性呈相同的变化趋势，贮藏第0～8 d升高，第8～12 d下降，在整个贮藏期间处理果实PME活性始终低于对照组，并且在贮藏第6、8和12 d显著低于对照。

图6 甜菜碱处理对南果梨果实PME和PG活性的影响Fig.6 Effects of glycine betaine treatment on the activities of pectin methylesterase and polygalacturonase of Nanguo pears

由图6（b）可知，整个贮藏过程中，甜菜碱处理和对照果实PG活性总体呈现出相同的变化趋势。贮藏第0～6 d，对照和甜菜碱处理果实PG活性呈上升趋势；第6～12 d，PG活性逐渐降低。在整个贮藏期间，甜菜碱处理果实的PG活性始终低于对照，并且在贮藏第4～12 d二者差异显著。贮藏第8、10和12 d，对照果实PG活性分别是甜菜碱处理果实的1.28、1.36和1.70倍。

2.7 甜菜碱处理对南果梨果实PMTE和PGTE活性的影响

PMTE和PGTE是两种重要的果胶裂解酶，与采后果实的软化密切相关。由图7（a）可知，整个贮藏过程中，甜菜碱处理和对照果实PMTE活性呈先升高后缓慢下降的变化趋势，并且甜菜碱处理果实PMTE活性始终低于对照组，在贮藏第4～6 d差异显著。对照和处理果实PMTE活性在贮藏第6 d达到最大，对照果实PMTE活性是处理果实的1.19倍。

图7 甜菜碱处理对南果梨果实PMTE和PGTE活性的影响Fig.7 Effects of glycine betaine treatment on the activities of pectin methyl-trans-eliminase and polygalacturonic acid trans-eliminase of Nanguo pears

如图7（b），随着贮藏时间的延长，甜菜碱处理果实PGTE活性始终低于对照果实，二者均呈现先升高后下降的趋势。贮藏第0～4 d，甜菜碱处理和对照果实PGTE活性急剧升高，在第6 d达到最大，从第6 d开始，二者均开始下降。在贮藏第 4、8、10和 12 d，甜菜碱处理果实 PGTE 活性显著低于对照果实，分别是对照果实的81.1%、87.4%、82.5%和74.8%。

3 讨论

本试验发现甜菜碱处理能够有效降低南果梨果实的失重率、抑制呼吸速率，并且显著降低呼吸高峰值。研究发现，苯并噻重氮处理能够显著抑制南果梨果实呼吸速率的升高和失重率的增加，并保持较好的品质。由此表明，采后安全化学药物处理通过抑制呼吸速率和失重来保持果实的品质。果实的硬度、可溶性固形物含量和可滴定酸是衡量果实贮藏品质的重要指标。果实硬度的下降主要由失水和果胶物质降解等引起。于冠年［27］研究发现，采后1-MCP处理明显延缓南果梨果实果肉的硬度下降，抑制可溶性固形物含量的上升和可滴定酸的下降。本试验结果表明，甜菜碱处理有效抑制了南果梨果肉硬度和可滴定酸的下降；但可溶性固形物含量变化与前人研究结果有所差异，主要是因为甜菜碱延缓了南果梨果实后熟过程中淀粉转化为可溶性糖。

PG和PME是参与细胞壁降解的关键酶，PG将多聚半乳糖醛酸降解为半乳糖醛酸，使细胞壁结构解体；PME能作用于果胶，脱去甲氧基生成低甲氧基果胶；PGTE和PMTE属于果胶裂解酶，PGTE裂解果胶酸分子中的 α-1，4糖苷键，而PMTE降解细胞壁中的果胶或甲酯化的多聚半乳糖醛酸［28］。程园等［29］研究发现，硝普钠处理能够抑制南果梨果实PG、PME、PGTE和PMTE活性的升高，有效延缓南果梨果实的软化。本研究发现，甜菜碱处理显著抑制了南果梨果实PG、PGTE、PME 和PMTE 活性的升高。由此表明，外源甜菜碱处理延缓果实的软化与其抑制果胶物质降解酶活性密切相关。

综上所述，外源甜菜碱处理能够显著抑制南果梨果实呼吸高峰值，并保持硬度，延缓失重率的增加，抑制可滴定酸的下降和可溶性固形物含量的升高，并且甜菜碱处理保持果实的品质与其抑制细胞壁降解酶活性有关。