富含γ-氨基丁酸发酵豆酸乳的研制

方颖，陈依彤，林咏珊，程京燕，高向阳

(1.华南农业大学 公共基础课实验教学中心 广州510642；2.华南农业大学 食品学院，广州510642；3.珠海微豆生物技术有限公司，广东珠海519000）

0 引言

发酵后的豆酸乳能够克服大豆固有的抗营养性、豆腥苦涩味等不良性质，还能合成（和富集）原来不具有的或低含量的功能性成分物质，如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）[1-3]，有效提高发酵豆制品的功能性品质、改良感官评价以及特性等。目前对于富集GABA的发酵工艺研究涉及的原料包括豆类、谷类以及乳制品等，如小红豆奶发酵[4]、大麦啤酒[5]、发酵乳制品[6-7]、功能面包制品[8]、茶[9]等，而以大豆为主要发酵原料富集GABA尚未见报道。本文以大豆粉为主要原料，采用混合乳酸菌发酵豆乳，以感官评定和GABA质量浓度为指标，探究了发酵工艺条件对豆酸乳GABA的影响，调控了产GABA的发酵条件，为研发富集GABA的豆酸乳提供理论基础。

1 实 验

1.1 试剂

混合大豆粉由珠海微豆生物技术有限公司提供；混合乳酸混合菌（Lactobacillus plantarum；Lactobacillus helveticus；Bifidobacterium animalis；Bacillus subtilis），实验室保藏菌；谷氨酸钠标准品，Sigma公司；γ-氨基丁酸，Sigma公司；H型氨基酸混合标准溶液氨基酸分析，日本Wako公司；MCI Buffer L-8500-PH Kit氨基酸分析，日本Wako公司；日立分析仪专用茚三酮显色溶液套装 氨基酸分析，日本Wako公司；茚三酮、正丁醇、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠、磺基水杨酸、无水乙醇等试剂均为广州化学试剂厂；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

L-8900型氨基酸分析仪，日本日立公司；DRP-9052型电热恒温培养箱，上海培因实验仪器有限公司；5910R高速冷冻离心机，德国艾本德；PHS-3E型p H计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

大豆粉溶解→均质→杀菌→冷却（35～40℃）→接种→保温发酵→冷藏后熟（0～4℃，12 h）→成品→感官评定、GABA质量浓度测定

1.3.1 发酵豆酸乳的制备

使用搅拌机将100 g大豆粉溶解于500 mL的50℃无菌水中，搅拌5 min使其均匀，滤网过滤并控制避免泡沫形成，将豆液分装至发酵容器中各20 g，并调节p H。待豆液降低温度冷却至35～40℃时加入乳酸菌粉轻微搅拌均匀，封口，置于设定温度和时间的恒温培养箱中进行发酵，发酵完成置冰箱冷藏后熟12 h，备用。

1.3.2 纸层析法分析GABA

参照张敏等[10]的方法并略有改动。

前处理：取发酵样品沸水浴5 min，转速为12000 r/min离心5 min后取上清液待测。

层析过程：称取并在层析缸中添加展开剂（正丁醇∶冰醋酸∶水=2∶1∶1）与显色剂（8 g/L茚三酮），预饱和2 h。将新华三号滤纸裁剪成所需大小，滤纸下端2 cm处轻画一条直线。在直线上每隔2 cm进行点样，样品分别为2 g/L的GABA标样、2 g/L谷氨酸钠标样和样品发酵液。层析后取出滤纸于90℃烘箱中显色10 min。通过测量计算比移值Rf对GABA和谷氨酸进行初步定性。

1.3.3 氨基酸分析仪测定GABA质量浓度

参考方法《JY/T 0194-1996氨基酸分析方法通则》[11]。豆酸乳GABA质量浓度测定前进行样品处理：取发酵样品离心，取上清液沸水浴5 min，冷却后加入2倍体积5%磺基水杨酸，放4℃冰箱静置过夜；次日以转速为12000 r/min离心取上清，加入4倍无水乙醇振荡后，放4℃冰箱静置过夜；随后转速为12000 r/min离心取上清，旋转蒸发器去除乙醇，用0.02 mol/L HCl定容后，过0.45μm滤膜，得供试样品备用。

氨基酸分析仪检测环境及检测条件：温度22℃；相对湿度60%；色谱柱：日立855-4507型；柱温：程序变温；反应柱温：135℃；柠檬酸（锂）p H缓冲液梯度洗脱；检测波长：570 nm+440 nm；流速：洗脱泵0.35 mL/min，衍生泵0.30 mL/min；分析时间：148 min。

标准氨基酸浓度C0100μmol/L，进样量20μL。定量公式如式（1）和式（2）所示，即：

式中：X为样品中氨基酸质量分数；C为样品测定液中氨基酸质量浓度，ng/20μL；F为样品稀释倍数；V为定容体积，mL；M为样品称样量。

外标单点校正法公式为

式中：C为氨基酸质量分数；A为峰面积。

1.3.4 发酵豆酸乳感官质量评价

评分依据的制定参考《GB/T 30885-2014植物蛋白饮料 豆奶和豆奶饮料》[12]。组织具有食品专业背景与食品感官评估经验的10人感官评定专家小组对发酵豆酸奶做感官质量评价，取其总分的平均值作为最终结果的评估。满分100分，具体评分依据见表1。

表1 感官评价标准

2 结果与分析

2.1 纸层析法定性GABA

纸层析法对发酵酸豆奶中谷氨酸和GABA分析结果如图1和表2所示。采用展开剂为v正丁醇∶v冰醋酸∶v水=2∶1∶1，显色剂为茚三酮，快速鉴定发酵豆酸乳中含有GABA，结果如图1所示，发酵液样品在对应GABA位置形成斑点，标准样品的显色效果较好，斑点均清晰、无重叠、无拖尾，说明分离GABA和谷氨酸钠的效果好；样品从左至右分辨为GABA标样，谷氨酸钠标样，样品1的GABA，样品1的谷氨酸钠，其显色的斑点的Rf值分别为0.769，0.615，0.782，0.603。

表2 发酵豆酸乳纸层析法分离GABA的比移值

图1 发酵豆酸乳纸层析法分析GABA

2.2 氨基酸分析仪分析氨基酸结果

采用了外标单点校正的方法对发酵豆酸乳进行氨基酸测定，结果表明检出的氨基酸有赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸、苏氨酸（Thr）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）、组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、GABA、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）等，特别是婴幼儿所需要的必须氨基酸如精氨酸（Arg）、胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、牛磺酸（Tau），未检出苯丙氨酸（Phe）（标准色谱图见图2）。检测样品中各氨基酸均能达到基线分离，峰形稳定，GABA的出峰时间为65.340 min，采用外标单点校正法计算出GABA的质量浓度。

图2 氨基酸标品测定曲线

2.3 影响豆酸乳发酵的条件

2.3.1 混合菌接种量的影响

设置混合菌接种量为0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%；其余发酵条件为初始发酵p H值为7，发酵温度40℃，发酵时间10 h；考察了混合菌接种量对感官品质和GABA质量浓度的影响，结果如图3所示。混合菌接种量的增加会导致发酵过度、代谢副产物增多、产酸过多，在超过0.6%后，豆酸乳的组织状态粗糙、不均匀、分层，乳清析出逐渐严重，口感过酸，感官品质降低，因此，混合菌接种量为0.6%时感官品质最理想。

图3 混合菌接种量对感官品质和GABA质量浓度的影响

随着混合菌接种量逐渐增加，GABA质量浓度相应增加，当混合菌接种量大于0.6%后，继续增加混合菌接种量对GABA质量浓度的增加影响不大。综合考虑，确定最佳的混合菌接种量为0.6%。

2.3.2 初始发酵p H值的影响

初始发酵p H值的控制对豆酸乳GABA的含量至关重要，GABA的生物合成途径主要由p H值调节，对发酵过程具有显著作用，同时，不同的微生物发酵菌种的GAD生化特性不一样最适的p H值也不一样，高产GABA的最适p H值是取决于菌种种类的[13]。发酵的初始p H值对最终的GABA产量有决定性影响，因此发酵液的p H值最好及时保持最佳p H值[14]。

设置初始发酵p H值为4，5，6，7，8；其余条件控制为混合菌接种量0.5%、发酵温度40℃、发酵时间10 h。制得发酵豆酸乳并进行感官品质和GABA质量浓度的测定，根据感官品质评分和GABA定量比较结果确定最佳初始p H值。由图4可知，p H值为6的感官品质与p H值为7的相差不大，都呈淡黄色、颜色分布均匀，有浓郁的豆香味，口感细腻，气味协调，组织状态细腻均匀不分层，乳清析出正常；p H值为4和p H值为5的感官品质极低，与其他组相差甚大，其发酵效果非常不理想，基本上相当于没发酵，还是豆液的状态，并且有异味；p H值为8的感官品质较低，主要是乳清析出比较多。同时，p H值为5时GABA质量浓度最高，其次p H值为6，7，8；其GABA质量浓度也较高，经比较三者差别很小；而p H值为4时GABA质量浓度最低。综合考虑，确定采用初始p H值为7为最佳发酵初始p H值。

图4 初始pH值对感官品质和GABA质量浓度的影响

2.3.3 发酵温度的影响

发酵温度也是影响GABA最大发酵产量的重要因素，发酵温度除了影响生物催化剂活性和稳定性，对反应热力学平衡也有影响。保证一定的细胞密度和适宜的培养温度可促使谷氨酸高效转化为γ-氨基丁酸[15]。需要综合考虑去控制合适的发酵温度，使之同时得到感官品质高和GABA质量浓度高的豆酸乳。

分别设置发酵温度为30，35，40，45，50℃。其余条件控制为混合菌接种量0.5%，初始p H值为7，发酵时间10 h。制得发酵豆酸乳并进行感官品质和GABA测定，根据感官品质和GABA定量比较结果确定最佳发酵温度。由图5可以看出，感官品质先升高后降低，发酵温度为40℃时，得到均匀淡黄色，发酵豆香味和滋味、组织细腻均匀，微量乳清析出的豆酸乳。随着发酵温度的升高，GABA质量浓度先升高后降低，发酵温度为40℃时GABA质量浓度最高，且与其他组差别明显，当温度超过40℃之后，GABA质量浓度降低趋势较快，这可能是温度升高使谷氨酸脱羧酶逐渐失活。综合考虑，确定最佳的发酵温度为40℃。

图5 发酵温度对感官品质和GABA质量浓度的影响

2.3.4 发酵时间的影响

发酵时间对于在发酵过程中富集GABA也是一个重要的因素。发酵时间过短，感官上会造成凝固不完全等现象，GABA生成量太低，如本研究所添加的Lb.plantarum需要72 h的发酵才能达到GABA的最高产量[16]；但发酵时间过长，发酵过度，产酸过多，代谢副产物增多，也会导致乳清析出过多，产品分层等现象，使产品感官品质降低。需要综合考虑去控制合适的发酵时间，使之同时得到感官品质高和GABA质量浓度高的豆酸乳。

分别设置发酵时间为8，10，12，14，16 h。其余条件控制为混合菌接种量0.5%，发酵温度40℃，初始p H值为7。制得发酵豆酸乳并进行感官品质和GABA测定，根据感官品质和GABA定量比较结果确定最佳发酵时间。由图6可以看出，随着发酵时间的延长，感官品质先升高后降低，发酵时间为12 h时感官品质最好，之后感官品质降低较明显，发酵逐渐过度，乳清析出加重，口感也过酸。由图6可以看出，随着发酵时间的延长，GABA含质量浓度在持续增加，但增长趋势缓慢。综合考虑，确定最佳的发酵时间为12 h。

图6 发酵时间对感官品质和GABA质量浓度的影响

3 结 论

本研究以大豆粉为主要发酵原料，乳酸菌为发酵菌开发富含GABA的发酵豆酸乳。以感官质量评分和GABA质量浓度为指标，利用纸层析法快速定性、氨基酸分析仪定量比较探究不同发酵条件对发酵豆酸乳的影响。在本研究中，基于单因素分析法，混合菌接种量、发酵温度、发酵时间是影响GABA产量的主要因素，当采用发酵条件为：混合菌接种量0.6%，初始发酵p H值为7，发酵温度40℃，发酵时间12 h，此时制得豆酸乳中GABA质量浓度为13.22μg/mL，使得发酵豆酸乳中GABA质量浓度大幅提高，同时具有优良感官质量品质评价。许多研究表明富含GABA的食物可以降低剂量依赖的自发性高血压小鼠的血压[17]，Inoue K等人[18]研究表明持续12周每天摄取10 mg的GABA对于轻度高血压患者有效；Kono I.和Park K.B.的研究[19-20]指出当食物中的GABA保证一定摄入量，则可调节疼痛和焦虑感以及血清中的脂质水平并改善记忆力和学习能力。因此，摄取一定的豆酸乳可以满足有GABA保健需求的消费者。这些健康益处吸引了医疗、化学和食品行业的兴趣，在食品中添加或富集GABA，开发更多有效的生物活性功能性的GABA补充剂，能够提升食品的营养健康价值具有良好的应用前景。

本研究探索将乳酸菌产GABA应用于功能性豆制品开发过程的发酵条件的优化，研究富集GABA发酵豆酸乳的工艺方法和考察评估感官质量，可为开发富含GABA的功能性食品、丰富大豆及其制品的原料豆类提供参考。作为富集GABA的新型功能性豆制品，既要求达到富集GABA的产量，也满足发酵豆酸乳的良好口感，需针对生产工艺不断进行优化。相信富含GABA的豆酸乳的研发成功，将为我国大豆产业的深加工延伸及其技术发展，增添新亮点。