婴幼儿乳粉中二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸的测量不确定度评定

张方圆，王李平，潘云山，朱大林，李雪莹

（广东省科学院 广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心）广东省化学危害应急检测技术重点实验室 广东省保健食品功效成分检测与风险物质快速筛查工程技术研究中心，广州510070）

0 引言

二十碳四烯酸（arachidonic acid,ARA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是人体必需的不饱和脂肪酸，在婴幼儿的生长发育中有重要作用，参与脑细胞的形成和发育，提升婴幼儿的智力发育水平和视力敏锐度[1]。目前，主要采用GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》[2]来测定婴幼儿食品中ARA和DHA含量。

测量不确定度是表征测量结果准确度的参数，是衡量检测结果质量的重要指标[3-4]。通过对不确定度的分析和评定，可以找出影响检测结果的关键步骤，从而提高检测结果的准确性[5-7]。本文采用GB 5009.168-2016第一法测定了婴幼儿乳粉中ARA和DHA的含量，并按照《CNAS-GL006:2019分析化学中不确定度的评估指南》[8]建立测量过程的数学模型，分析不确定来源，评定测定结果的标准不确定度和扩展不确定度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

十一碳甘油三酯，NU-CHEK PREP,INC；混合脂肪酸甲酯标准品40项，NU-CHEK PREP,INC；无水乙醇（色谱纯），广州化学试剂厂；乙醚（色谱纯），广州化学试剂厂；石油醚Ⅰ（色谱纯），广州化学试剂厂；甲醇（色谱纯），广州化学试剂厂；正庚烷（色谱纯），广州化学试剂厂；三氟化硼甲醇溶液(浓度为14%），上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent GC 7820A气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；HP-88色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25μm），美国安捷伦科技有限公司；Sartorius BT125D电子天平，赛多利斯工业称重设备（北京）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；0XW-80A旋涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验原理

依据GB 5009.168-2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》第一法内标法测定婴幼儿乳粉中ARA和DHA含量。该方法的原理如下：加入内标物的试样经水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在碱性条件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，经气相色谱分析，内标法定量测定脂肪酸甲酯的含量。依据ARA和DHA甲酯含量和转换系数计算出ARA和DHA的含量。

1.3.2 标准工作溶液的制备

脂肪酸甲酯混合标准溶液：准确称取脂肪酸甲酯混标0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A级)中，制成质量浓度6.524 mg/mL的混合标准溶液（共分为50个均量单位，每个单位为0.1305 mg/mL）。

十一烷酸甘油三酯内标溶液：准确称十一碳酸甘油三酯标准品0.08234 g用甲醇定容于50.0 mL容量瓶(A级)中，制成1.630 mg/mL的十一碳酸甘油三酯内标溶液。

1.3.3 样品的处理

试样的称取：准确称取均匀试样1 g(精确至0.0001 g)，于250 mL容量瓶中，准确加入2.0 mL十一烷酸甘油三酯内标溶液。加入约100 mg焦性没食子酸，加入几粒沸石，再加入2 mL 95%乙醇和4 m L水，混匀。

试样的水解：采用酸水解法：加入盐酸溶液10 mL，混匀。将烧瓶放入80℃水浴中水解40 min。每隔10 min振荡一下烧瓶，使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中。水解完成后，取出烧瓶冷却至室温。

脂肪提取：水解后的试样，加入10 mL 95%乙醇，混匀。将烧瓶中的水解液转移到分液漏斗中，用50 mL乙醚石油醚混合液冲洗烧瓶和塞子，冲洗液并入分液漏斗中，加盖。振摇5 min，静置10 min。将醚层提取液收集到250 mL烧瓶中。按以上步骤重复提取水解液3次，最后用乙醚石油醚混合液冲洗分液漏斗，并收集到250 mL烧瓶中。旋转蒸发仪浓缩至干，残留物为脂肪提取物。

脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠甲醇溶液8 mL，连接回流冷凝器，80℃水浴上回流，直至油滴消失。从冷凝器上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液，在80℃水浴中继续回流2 min。用少量水冲洗冷凝器。停止加入，从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温。准确加入25 mL正庚烷，振摇2 min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正庚烷提取溶液大约5 mL，至25 mL试管中，加入大约3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定。

1.3.4 色谱条件

载气：氮气，流速：0.8 mL/min；空气：450 mL/min；氢气：40 m L/min；升温程序：100℃保持2 min，以10℃/min速率升温至150℃，再以2℃/min速率升温至220℃，保持3 min，再以10℃/min速率升温至230℃，保持1 min；进样口温度：250℃；检测器温度：270℃；进样方式：分流进样，分流比为10∶1；进样量：1μL。

1.4 ARA、DHA含量计算

婴幼儿乳粉中ARA、DHA含量的计算公式为：

式中：Xi为试样中脂肪酸甲酯i的质量分数(mg/100g)；Fi为脂肪酸甲酯i的响应因子；Ai为试样中脂肪酸甲酯i的峰面积；AC11为试样中加入的内标物十一碳酸甲酯峰面积；CC11为十一碳酸甘油三酯质量浓度(mg/mL)；VC11为试样中加入十一碳甘油三酯体积(mL)；1.0067为十一碳酸甘油三酯转化成十一碳酸甲酯的转换系数；FFAME-FA为脂肪酸甲酯转化成脂肪酸的转换系数，ARA为0.9560，DHA为0.9590；m为试样的质量(g)。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

按照数学模型和测量方法，分析其不确定度来源有：响应因子Fi测定产生的不确定度；样品称量m所引入的不确定度；十一碳酸甘油三酯内标溶液浓度C11产生的不确定度；十一碳酸甘油三酯加入体积V11带来的不确定度；样品重复测量产生的不确定度以及气相色谱仪器定量误差产生的不确定度。

2.2 响应因子Fi的不确定度分析

取混合脂肪酸甲酯标准溶液，按上述色谱条件连续进样6针，根据十一碳酸甲酯、ARA甲酯、DHA甲酯的浓度和峰面积计算响应因子。

响应因子Fi的计算公式为

式中：Fi为脂肪酸甲酯i的响应因子；CSi为混标中各脂肪酸甲酯i的质量浓度(mg/mL)；A11为试十一碳酸甲酯峰面积；Ai为脂肪酸甲酯i的峰面积；C11为混标中十一碳酸甲酯的质量浓度(mg/mL)。因此，Fi的相对不确定度urel（Fi）由以下3个分量合成：混合标准溶液中十一碳酸甲酯引入的相对标准不确定度urel（IS11），混合标准溶液中ARA甲酯和DHA甲酯引入的相对标准不确定度urel（Si），以及测定过程中引入的测量不确定度urel（Fi）。

2.2.1 混合标准溶液中十一碳酸甲酯的不确定度分析

准确称取脂肪酸甲酯混标0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A级)中，制成6.524 mg/mL的混合标准溶液（共分为50个均量单位，每个单位为0.1305mg/mL）。

2.2.1.1 标准品纯度

脂肪酸甲酯混标纯度＞99%，可认为其最大允许误差为1.0%。按均匀分布处理，标准品纯度引入的标准不确定度为：u(p11)=0.01/=0.00577%，相对标准不确定度为：urel(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.2.1.2 标准品称量

称取标准品164.76 mg，所使用的天平，其示值误差测量结果的扩展不确定度为0.03 mg(k=2)，重复性偏差为0.02 mg(由检定证书提供)。前者的标准不确定度为0.03/2=0.015 mg；后者为0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在称重时应重复计算两次不确定度(一次为清零时，另一次为最后读数时)。因此标准品称量mstd标准不确定度和相对标准不确定度分别为u(mstd)==0.0257 mg；urel(mstd)==0.000156。

2.2.1.3 标准溶液配制与稀释过程的相关体积

混合标准溶液的配置中使用25 mL容量瓶定容。根据JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[9]规定，20℃时25 mL容量瓶(A级)的容量允差为±0.03 mL，取矩形分布，则标准不确定度为=0.017 mL；对典型25 mL容量瓶充满10次并称量的实验，得标准偏差为0.028 mL，即为标准不确定度；容量瓶在20℃校准，本测试是在25℃的条件下进行的，容量瓶和溶液温度与校准时不同所引起的体积变化为±25 m L×5℃×1.24×10-3℃-1=0.000155 mL(1.24×10-3℃-1为正庚烷的体积膨胀系数)，取矩形分布，则温度对体积的影响所引入的标准不确定度为0.0000895 mL。温度效应引入的不确定度远小于校准和重复性的不确定度,因此在以下的评定中忽略温度的影响。则，25 mL容量瓶体积Vflask引入的标准不确定度为u(Vflask)==0.0329 mL；相对标准不确定度为urel(Vflask)==0.00132。

由于混合标准溶液的配置中仅使用25 mL容量瓶定容，因此标准溶液配制与稀释过程的相关体积Vstd引起的相对标准不确定度urel(Vstd)=urel(Vflask)=0.00132。

综上所述：混合标准溶液中十一碳酸甲酯浓度引入的不确定度为

2.2.2 混合标准溶液中ARA甲酯、DHA甲酯的不确定度分析

准确称取脂肪酸甲酯混标0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A级)中，制成质量浓度为6.524 mg/m L的混合标准溶液（共分为50个均量单位，每个单位为0.1305 mg/mL）。

2.2.2.1 标准品纯度

脂肪酸甲酯混标纯度＞99%，可认为其最大允许误差为1.0%。按均匀分布处理，标准品纯度引入的标准不确定度为u(p11)=0.01/=0.00577%相对标准不确定度为urel(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.2.2.2 标准品称量

称取标准品164.76 mg，所使用的天平，其示值误差测量结果的扩展不确定度为0.03 mg(k=2)，重复性偏差为0.02 mg(由检定证书提供)。前者的标准不确定度为0.03/2=0.015 mg；后者为0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在称重时应重复计算两次不确定度(一次为清零时，另一次为最后读数时)。因此标准品称量mstd标准不确定度和相对标准不确定度分别为u(mstd)=)=0.0257 mg；urel(mstd)==0.000156。

2.2.2.3 校准标准溶液配制与稀释过程的相关体积

混合标准溶液的配置中使用25 m L容量瓶定容，由2.2.1.3可知，25 mL容量瓶体积引入的标准不确定度为u(Vflask)==0.0329 mL；相对标准不确定度为urel(Vflask)==0.00132。

由于混合标准溶液的配置中仅使用25 mL容量瓶定容，因此标准溶液配制与稀释过程的相关体积Vstd引起的相对标准不确定度urel(Vstd)=urel(Vflask)=0.00132。

综上所述：混合标准溶液中ARA甲酯和DHA甲酯浓度引入的不确定度均为

2.2.3 响应因子Fi的测量不确定度

6次测定的ARA甲酯响应因子分别为0.9156，0.9088，0.9142，0.9028，0.9186，0.9074；DHA甲酯响应因子分别为0.9027，0.8995，0.9013，0.8889，0.8978，0.8948。标准不确定度采用平均值的标准偏差(n=6)，分别为

因此，响应因子测定产生的相对标准不确定度分别为

2.3 样品称量m的不确定度分析

称样1 g，天平检定证书提供的示值误差测量结果的扩展不确定度为0.3 mg(k=2)，重复性偏差为0.1 mg(由检定证书提供)。前者的标准不确定度为0.3/2=0.15 mg；后者为0.1/1.96=0.0510 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在称重时应重复计算两次不确定度(一次为清零时，另一次为最后读数时)。其标准不确定度和相对标准不确定度分别为

2.4 十一碳酸甘油三酯内标溶液浓度C 11的不确定度

准确称十一碳酸甘油三酯标准品0.08234 g用甲醇定容于50.0 mL容量瓶(A级)中，制成质量浓度为1.630 mg/mL的十一碳酸甘油三酯内标溶液。

2.4.1 标准品纯度

十一碳酸甘油三酯标准品纯度＞99%，可认为其最大允许误差为1.0%。按均匀分布处理，标准品纯度引入的标准不确定度为：u(p11)=0.01/=0.00577%相对标准不确定度为uret(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.4.2 标准品称量

称取标准品82.34 mg，所使用的天平，其示值误差测量结果的扩展不确定度为0.03 mg(k=2)，重复性偏差为0.02 mg(由检定证书提供)。前者的标准不确定度为0.03/2=0.015 mg；后者为0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在称重时应重复计算两次不确定度(一次为清零时，另一次为最后读数时)。因此标准品称量m11标准不确定度和相对标准不确定度分别

2.4.3 校准标准溶液配制与稀释过程的相关体积

内标溶液的配制中使用50 mL容量瓶定容。根据JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[9]规定，20℃时50 mL容量瓶(A级)的容量允差为±0.05 mL，取矩形分布，则标准不确定度为0.029 mL；对典型50 mL容量瓶充满10次并称量的实验，得标准偏差为0.053 mL，即标准不确定度；容量瓶在20℃校准，本测试是在25℃的条件下进行的，容量瓶和溶液温度与校准时不同所引起的体积变化为±50 m L×5℃×1.10×10-3℃-1=0.00275 mL(1.10×10-3℃-1为正己烷的体积膨胀系数)，取矩形分布，则温度对体积的影响所引入的标准不确定度为0.00159 mL。温度效应引入的不确定度远小于校准和重复性的不确定度,因此在以下的评定中忽略温度的影响。则，50 m L容量瓶体积Vflask50引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别为

由于十一碳酸甘油三酯内标溶液的配置中仅使用50 mL容量瓶定容，因此十一碳酸甘油三酯内标溶液配置过程的相关体积V11引起的相对标准不确定度urel(V11)=urel(Vflask50)=0.00121。

综上所述：十一碳酸甘油三酯内标溶液浓度引入的不确定度：

2.5 十一碳酸甘油三酯内标溶液加入体积V的不确定度分析

实验中，使用2.0 mL分度吸量管准确加入内标2.0 mL。根据JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》规定[9]，20℃时0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL分度吸量管的容量允差、分布、标准不确定度计算如表1。

表1 流出式分度吸量管（A级）的标准不确定度

分别对典型0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL分度吸量管充满10次并称量的实验，得标准偏差分别为0.0025，0.005，0.008，0.0125，0.0200，0.0500 mL，即标准不确定度。因此2.0 mL分度吸量管合成标准不确定度和相对标准不确定度分别为=0.0106 mL；=0.0053。因此，十一碳酸甘油三酯内标溶液加入体积V引入的相对标准不确定度为urel(V)=0.0053。

2.6 样品重复测量产生的不确定度

制样过程产生的不确定度采用6次样品测定结果的相关数据进行计算。ARA质量分数6次的测定结果为：48.3、49.6、48.9、49.0、49.2、47.5 mg/100 g，平均质量分数为=48.7 mg/100g，标准偏差为SARA=0.73 mg/100 g。DHA质量分数6次的测定结果为：27.4、27.9、27.3、27.9、28.0、27.1 mg/100 g，平均质量分数为xDHA=27.6 mg/100 g，标准偏差为SDHA=0.35 mg/100 g。重复测量产生的标准不确定度和其相对标准不确定度分别为：

2.7 GC量校准

由仪器校准证书知，GC定量的允差是3%，取矩形分布，则相对不确定度为：urel(Q)=。

2.8 合成不确定度和扩展不确定度

婴幼儿乳粉中ARA和DHA质量分数测定的不确定度分量如表2所示。

表2 婴幼儿乳粉中ARA和DHA质量分数测定的不确定度分量

因各分量相互独立不相关，因此样品中ARA和DHA测定结果的相对合成不确定度为

ARA的质量分数为：XARA=xARA=48.7 mg/100 g；DHA的质量分数为：XDHA=xDHA=27.6 mg/100g。则标准合成不确定度为：

不确定度各分量按正态分布处理，取包含因子k=2，置信水平P为95%，所以扩展不确定度为

因此，本次测定的婴幼儿乳粉样品中ARA的质量分数为CARA=(48.7±2.2)mg/100 g（k=2，P=95%）；DHA的质量分数为CDHA=(27.6±1.2)mg/100 g（k=2，P=95%）。

3 结 论

本文按照《CNAS-GL006:2019分析化学中不确定度的评估指南》对GB 5009.168-2016第一法测定婴幼儿乳粉中ARA和DHA质量分数的不确定度进行评价。通过对不确定度评定和来源分析可知，本次测定的不确定来源主要为气相色谱仪的定量误差及重复性引入的不确定度。因此，在实验过程中增加平行测定次数，严格按照标准方法，规范操作，并对检测仪器进行必要的维护，确保仪器的稳定状态，能够有效降低实验结果的不确定度，提高实验结果的准确性和实验室的检测质量。