UPLC-MS/MS同时测定特殊医学用途配方食品中8种真菌毒素

李莉，李硕

（中国食品药品检定研究院，北京100050）

0 引言

特殊医学用途配方食品由于食用人群的特殊性[1]，质量安全问题一直受到消费者的高度关注。黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和杂色曲霉素等真菌毒素，对人体具有潜在的致癌性[2]，如果产品原料质量和生产环节把控不严格，就有可能造成终产品被真菌毒素污染。目前食品中真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法[3-6]、高效液相色谱法[7-10]、液质谱联用法[11-15]。液质联用和快速样品前处理技术的联合应用[16-19]，具有高灵敏度和优异的选择性，应用优势日益突出。本文建立了直接通过式固相萃取结合UPLC-MS/MS技术检测特殊医学用途配方食品中8种真菌毒素的方法，该方法简便快速，可操作性强，可以实现特殊医学用途配方食品中多种黄曲霉毒素的同时快速筛查。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8060型超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，日本岛津公司；AL 204型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司；涡旋混匀器，美国Scientific Industries公司；CF 16RXII离心机，日本日立公司；MG-2200氮吹仪，日本东京理化公司；超纯水纯化系统，德国赛多利斯公司。黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1)、黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFG2)、黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM 1)、黄曲霉毒素M2(aflatoxin M2，AFM 2)混合标准溶液（10μg/mL），青岛普瑞邦公司；杂色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)标准溶液（50μg/mL），青岛普瑞邦公司；赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)标准溶液（10μg/mL），青岛普瑞邦公司；乙腈（色谱纯），德国默克公司；甲酸（质谱级），Fisher Scientific公司；Captiva EMR-Lipid萃取管（3 mL），Agilent公司；ISOLUTE Myco固相萃取柱（3 mL），Biotage公司；MPFC-QuEChERS超滤型净化柱（高脂类），北京绿绵科技有限公司；实验用水均为超纯水；特殊医学用途配方食品，市售。

1.2 标准溶液配制

分别准确移取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM 1、AFM 2混合标准溶液2 mL，ST标准溶液0.2 m L，OTA标准溶液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM 1、AFM 2质量浓度为2μg/mL、OTA和ST质量浓度为1μg/mL的混合标准储备溶液，-20℃避光保存。临用时以空白基质提取液将上述标准溶液稀释为系列混合标准工作液。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品的提取

精密称取2.5 g（精确至0.001 g）样品于50 mL具塞离心管中（对于加标样品，加入所需体积的标准溶液），加入20 mL乙腈-水(80∶20，v/v)提取溶液，旋涡混匀30 s，室温下超声提取30 min，随后经8000 r/min离心5 min，取上清液待净化。

1.3.2 样品的净化

移取上清液2 mL至Captiva EMR-Lipid萃取管，保持每秒1滴的流速，收集全部流出液，氮气吹干。用0.5 mL乙腈-水溶液（50∶50，v/v）复溶，涡旋混合1 min，过0.22μm聚四氟乙烯微孔滤膜，作为待测溶液。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Aglient Infinity Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7μm）；流动相A：A为含有0.1%甲酸的水溶液，B为含有0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温：40℃，洗脱程序：0～1 min，10%～20%B；1～9 min，20%～40%B；9～10 min，40%～95%B；10～14 min，95%B；14～16 min，10%B。进样量为5μL。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）模式；雾化气流量3 L/min，干燥气流量10 L/min，加热气流量10 L/min，DL管温度250℃，加热块温度400℃，接口温度300℃，接口电压4.0 k V。其他质谱参数如表1所示。

表1 各化合物质谱参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

使用各化合物质量浓度为100 ng/mL标准储备液，在ESI离子源条件下采用直接进样的方式分别进行正负离子扫描。实验结果表明8种化合物均在正离子模式下有更好的响应，因此选择ESI+模式。根据目标化合物的[M+H]+母离子，在多反应监测条件下进一步优化质谱条件，选择响应最强的2个子离子，得到使子离子响应最优的三重四级杆Q 1和Q 2的电压以及碰撞能。最终确定的质谱多反应监测条件参数如表1所示。

2.2 色谱条件优化

由于8种真菌毒素是极性或者弱极性化合物，常用选用C18色谱柱，水与乙腈或甲醇混合作为流动相进行色谱分离。流动相中添加甲酸可提高目标化合物的离子化效率，提高质谱检测的灵敏度。本研究对比了Aglient Poroshell 120 SB-C18柱(2.1 mm×100 mm，2.7μm)、Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)、Waters HSS T 3(2.1 mm×100 mm，1.8μm)柱在以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相时的分离效果，发现Aglient Poroshell 120 SB-C18柱更适合8种真菌毒素的快速分析，该柱填充2.7μm实心C18填料，其中实心内核为1.7μm，多孔外层为0.5μm，多孔外层和实心内核限制了扩散，提高了分离速度，而窄粒径分布则提高了柱效和分离度，从而得到更好的分离效果和色谱峰峰型。8种真菌毒素总离子流色谱如图1所示。

图1 8种真菌毒素总离子流色谱

2.3 提取溶剂的选择

根据文献报道，黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素常用的提取溶剂为乙腈或甲醇，在乙腈或甲醇中加入适量的水能够促进溶剂渗透到基质内部，提高真菌毒素的提取效率。此外，乙腈比甲醇具有较强的蛋白沉淀能力，当样品基质中蛋白质含量较多时，选取乙腈-水的混合溶液作为提取溶剂效果更好。因此，本研究以特殊医学用途婴儿配方食品为样品，通过空白基质加标的方式，考察60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液、80%乙腈水溶液和90%乙腈水溶液作为提取溶剂对于待测化合物回收率的影响，结果如图2所示。由图2可以看出，使用80%乙腈水溶液作为提取剂时8种真菌毒素的加标的回收率结果在64%～89%之间，可以满足实验要求。

图2 不同提取溶液对8种真菌毒素回收率的影响

2.4 样品净化方法的选择

特殊医学用途配方食品中蛋白质、脂类和糖类等物质含量较高，是影响质谱测定灵敏度的主要干扰基质，因此必须通过适当的净化方法加以去除。目前常用的复杂样品中真菌毒素的净化方法有免疫亲和柱法、SPE、QuEChERS技术等，其中免疫亲和柱价格昂贵，且只适用于单一或特定的化合物类别或样品类型，不适合多种毒素的同时测定。本实验对常规SPE净化柱（ISOLUTE Myco）、直接通过式净化柱（EMR-Lipid萃取管）和QuEChERS净化技术（MPFC-QuEChERS）3种不同净化方法的净化效果进行了评价，实验结果见图3。分析实验结果可以发现，QuEChERS方法能够高效、快速的萃取多类别的化合物，但同时也会萃取出大量基质（尤其是脂质），从而导致杂色曲霉素和赭曲霉毒素A基质效应明显、回收率偏低。常规的SPE净化方法对于黄曲霉毒素类化合物的净化效果要优于直接通过式净化柱和QuECh-ERS方法，但是操作上需经过活化、上样洗脱和淋洗等多个步骤，操作繁琐，且个别目标物的加标回收率过低，不适用复杂样品的快速分析。EMR-Lipid萃取管虽然对于黄曲霉毒素类物质的加标回收率不如其他两种净化方法，但是对于杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的加标回收率要优于其他两种净化方法，综合考虑8种目标化合物的结果，EMR-Lipid萃取管净化方法的加标回收率均＞60%，满足实验要求[19]。此外直接通过式净化柱无需活化、洗脱和淋洗，可大大缩短净化时间，因此选择EMR-Lipid萃取管作为样品前处理的净化方法。

图3 不同净化方法对8种真菌毒素回收率的影响

2.5 方法研究及结果分析

2.5.1 线性范围、回归方程和检出限

在质谱分析中，基质效应会严重影响痕量水平目标化合物定量分析的准确性[20]。为了补偿基质效应对检测结果带来的影响，本研究采用基质匹配标准曲线进行目标化合物定量分析。将不含待测物的空白样品按照1.3步骤进行处理得到空白基质溶液，用空白基质溶液稀释混合标准储备液得到系列浓度的基质加标溶液，上机测定。以8种真菌毒素的质量浓度(ng/mL)为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算目标化合物信号响应和噪声的比值S/N，得到方法检出限(limit of detections，LOD，S/N=3)和定量限(limit of quantifications，LOQ，S/N=10)，结果如表2所示。6种黄曲霉毒素在0.5～20 ng/mL质量浓度范围内、杂色曲霉素和赭曲霉素A在0.25～10 ng/mL质量浓度范围内呈线性关系，线性相关系数r＞0.992，8种真菌毒素的检出限为0.06～2.1μg/kg，定量限为0.2～2.9μg/kg。

表2 8种真菌毒素的线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.5.2 方法的回收率及精密度

向空白样品添加低、中、高3个浓度水平的标准溶液进行加标回收试验，按照方法给出的步骤进行样品提取、净化及上机检测，计算目标化合物的加标回收率。每个加标浓度平行测定6份，用测定结果的相对标准偏差评价精密度（relative standard deviation，RSD）。回收率和精密度结果如表3所示。由表3可以看出，8种真菌毒素的平均回收率为92.2%～108.9%，RSD小于15%。

表3 回收率和精密度实验结果（n=6）

2.5.3 实际样品检测

按照本实验建立的方法对购自不同产地和厂家的15份特殊医学用途配方食品进行检测，15批样品中均未检出8种真菌毒素。

3 结 论

本研究建立了采用新型固相萃取前处理方法结合液相色谱质谱联用检测技术同时测定特殊医学用途配方食品中多种类真菌毒素的快速筛查方法。直接通过式EMR-Lipid萃取管省去了常规萃取柱活化、洗脱和淋洗的步骤，可大大缩短净化时间，提高检测的效率，可以实现批量样品的快速检测。该方法简化了分析步骤，操作简便快捷，同时具有良好的准确度和精密度，能满足特殊医学用途配方食品中真菌毒素污染水平的监测和产品质量控制工作的需要。