六堡茶微生物多样性研究进展

杜金杰，刘晓纯，吴新慧，廖楷滨，覃玉娜，张灵枝

（华南农业大学园艺学院，广州 510642）

前言

六堡茶是广西历史名茶，与普洱茶、茯砖茶同属于后发酵黑茶类，其历史考究可追溯至1500年前。早在清朝嘉庆年间，六堡茶就以其独特的槟榔香被列为全国二十四名茶之一，后来清朝中后期由于长年盛销海外，特别是东南亚华侨聚集地，因此又被称为著名的“侨销茶”[1]。六堡茶色泽黑褐，汤色红浓明亮，滋味醇厚回甘，经一定环境、时间陈化后的六堡茶，还具有独特的槟榔香，素有“红、浓、陈、醇”四绝之称。近年来，随着六堡茶的市场热度逐渐升温，消费者对六堡茶的认知也不断加深，逐渐形成自己的消费认知意识。“槟榔香”这一品质特征逐渐成为很多消费者判断六堡茶好坏的标准。吴平等，研究得出六堡茶槟榔香为似槟榔(Areca catechu L.)干燥成熟种子或其切片的香气和滋味[2]。此外，六堡茶还具有抗氧化、降血糖、降血脂、增强免疫力、改善肠道微生物群落等保健功效，是一种健康之饮[3-5]。

六堡茶加工过程中，渥堆和陈化是形成六堡茶独特品质的关键工艺，微生物在渥堆和陈化中参与发挥着重要作用[6]。在茶产业助推乡村振兴的今天，六堡茶正飞速发展[7]，六堡茶微生物的研究也逐渐成为一大热点。国内目前对于六堡茶微生物的研究，主要集中于六堡茶微生物多样性分析；加工过程微生物的分离、鉴定以及微生物对六堡茶色泽、香气、滋味等感官品质和化学成分的影响。本文将综述过去20年，前人对六堡茶微生物的研究成果，为后人进一步深挖六堡茶微生物作用，改善六堡茶加工工艺提供一定参考。

1 微生物对六堡茶品质的影响

六堡茶加工工艺分为初制工艺和精制工艺，即毛茶加工和成品茶加工。渥堆和陈化是成品茶加工过程中形成“红、浓、陈、醇”品质风味的两个关键工艺，其中渥堆发酵过程有传统双蒸双压发酵工艺和冷水渥堆发酵工艺两种方法，渥堆时间按方法不同、原料等级不同，20-60天不等。而陈化技术标准要求最少陈化6个月的六堡茶才能成为成品茶出售[8]。但无论是渥堆发酵过程还是陈化过程，微生物都在其中发挥着重要作用。

微生物对六堡茶的品质影响主要分为两个方面，一方面是微生物自身繁殖代谢，产生生物热，改变茶坯温度，影响茶叶含水量，从而间接影响茶叶的发酵进程，使茶叶生化成分发生转化；另一方面是微生物代谢产生的各种胞外酶，对茶叶多酚类物质的氧化，蛋白质的降解，纤维素、果胶的分解以及香气物质如：α-雪松醇、β-芳樟醇、萘和甲氧基苯化合物等前体物质的形成提供生化动力[9,10]，从而形成黑茶独特的品质风味。杨洪元通过人工接种六堡茶中分离出来的“青霉+冠突曲霉+黑曲霉+毛霉+酵母菌”组合菌种用于发酵毛茶，取得与传统渥堆样相接近的品质效果，而其发酵时间大大缩短了近1/3[11]。欧惠算通过接种从六堡茶中分离的优势菌，进行单一菌种液态发酵，得到的结果显示：阿姆斯特丹散囊菌、江西青霉、塔宾曲霉、黑曲霉、灰黄青霉等发酵组的茶多酚、黄酮类、氨基酸、可溶性糖含量与无菌发酵对照组对比，均随着发酵时间的延长而不断减少，茶褐素含量则不断增加[12]。苏赞等，通过接种从梧州六堡茶中分离出来的三株散囊菌进行液态发酵，发现发酵后培养液的还原糖含量大幅增加，茶多酚含量显著提升[13]。胡沛然利用从六堡茶中分离鉴定出来的五株耐高温、产酶能力强的菌株进行六堡毛茶固态发酵，发现黑曲霉固态发酵组的茶汤颜色相对其他四种菌株的茶汤颜色更加红褐，发酵后茶叶的茶多酚含量显著降低，茶褐素含量显著增加[14]，其结论与欧惠算的结论一致。

对于微生物对六堡茶的品质和化学成分的影响，目前大多数还是停留在单一菌种或者组合菌种发酵后其感官品质和化学成分变化规律，对于其作用机理的探究目前还非常少，随着高通量测序和组学技术进一步发展，未来对其机理研究必定会进一步挖掘。届时各种有利于加速六堡茶渥堆发酵效率，形成不同品质风味的微生物发酵菌剂的开发和应用，必定能够大大加速六堡茶产业的发展。

2 六堡茶微生物多样性研究现状

2.1 初制过程微生物研究现状

目前并没有查阅到关于六堡茶初制过程微生物的分离鉴定结果的相关文献报道，其主要原因是六堡茶初制过程堆闷的时间非常短，一般只有10-15h[15]，其过程主要是通过湿热作用使茶叶内含物成分发生转换，相对精制过程20-60d的发酵时间，微生物的数量以及参与生化反应的作用都不显著，因此人们把重心放在了渥堆和陈化两个微生物显著参与作用的加工过程的微生物分离鉴定以及作用研究。

2.2 渥堆过程微生物研究现状

温志杰等，发现六堡茶渥堆过程存在大量的霉菌、酵母、细菌，不同层次的渥堆样微生物数量不一样。上层样的微生物数量在第一次翻堆后一直都是最多的，中层微生物的数量最少。进一步研究发现酵母菌是渥堆过程的优势菌种，在第二次翻堆时达到最大数量，比同期的霉菌数量高一个数量等级[16]。经过鉴定，确定其优势酵母菌为Arxula adeninivoran。后期生化实验证明Arxula adeninivoran能够参与各种糖类的同化作用[17]，而糖类物质是黑茶醇厚口感以及陈香风味的重要影响物质，由此可见六堡茶渥堆发酵过程，酵母菌对六堡茶“红浓陈醇”的独特风味有非常重要的影响，是不可忽视的一种重要微生物。欧惠算等，对比汽蒸前后茶样的真菌差异，发现汽蒸前分离鉴定出7种真菌分别为：塔宾曲霉、黑曲霉、胶红酵母、江西青霉、灰黄青霉、鞘氨醇单胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌，汽蒸后鉴定结果中没有黑曲霉和塔宾曲酶，认为剩余5种真菌对六堡茶陈化具有重要作用，其中包含一株六堡茶“金花菌”——阿姆斯丹散囊菌[18,19]。胡沛然通过控制温度条件，从渥堆茶叶中分离鉴定嗜热菌，鉴定得到细菌5个属，14个种；霉菌5个属，9个种。最终通过筛选，选出 3 株产多酚氧化酶嗜热菌，分别为Lichtheimia corymbifera（伞状毛霉菌）、Aspergillus tubingensis（塔宾曲霉）和Aspergillus fumigatus（烟曲霉）[14]。龙峻瑶等，采用高通量测序和传统培养法相结合，分析不同渥堆时间的六堡茶乳酸菌多样性，共鉴定到乳酸菌4 个属 5 个种，4 个属分别为：Lactobacillus（乳杆菌属）、Weissella（魏斯氏菌属）、Lactococcus（乳球菌属)和Enterococcus（肠球菌属)，其中乳杆菌属为优势菌，结论与杨雅焯等一致[20]。5个种分别为：Lactobacillus pentosus（戊糖乳杆菌)、Enterococcus casseliflavus（铅黄肠球菌)、Weissella paramesenteroides（类肠膜魏斯氏菌)、Weissella hellenica（希腊魏斯氏菌)、Lactococcus taiwanensis（台湾乳球菌)。经过进一步体外细胞水平实验证明，戊糖乳杆菌具有一定的去除胆固醇能力，是一种重要的茶源益生菌[21]。

表1 六堡茶渥堆过程微生物分离鉴定结果

2.3 陈化过程微生物研究现状

文献报道中专门研究180天陈化时间段内六堡茶微生物的相对很少，其原因可能主要是六堡茶一直有“越陈越好”、“越陈越香”的说法[22,23]，因此人们更倾向于研究陈放多年的六堡茶微生物分离鉴定与作用机理。廖庆梅等，发现陈化1个月的六堡茶表面长出了许多金黄色的“金花”。研究发现这些有益品质的黄霉菌, 它能分泌淀粉酶和氧化酶, 可催化茶叶中的淀粉转化为单糖, 催化多酚类化合物氧化, 使茶叶汤色变棕红, 消除粗青味[24]。陈庆金等，利用Miseq测序技术，从梧州茶厂陈化洞里取得的陈化了6d、50d、70d、90d的茶样中分离鉴定得到8个科、9个属，其中Coprinellus（小鬼伞属）、Cystolepiota（囊小伞属）、Gymnoascus Thielavia四个属是其他黑茶类没有检测到的。分析结果发现陈化6天的茶样微生物丰富度最高，其中曲霉属和散囊菌属是陈化初期的优势菌属[25]。

2.4 成品茶茶源微生物研究现状

关于六堡茶成品茶微生物分离鉴定的结果，其文献报道相对多一点。成品茶取样相对更加方便，能够直接从市面上买到，成品茶作为微生物发酵的“终产物”探究其微生物。毛彦等，从广西银泰六堡茶厂 2008 年产的六堡茶中分离纯化得到一株特征菌株“金花”菌，经形态鉴定和分子鉴定确定为Eurotium niveoglaucum（黄雪散囊菌）[26]。徐书泽等，利用高通量测序梧州茶厂4种茶样共鉴定得到6个科、8个属真菌类群包括：Aspergillus(黑曲属)、Eurotium(散囊菌属)、Penicilliuim（青霉属）、Blastobotrys Guehomyces Rasamsonia（蓝状菌属）、Rossbeevera Emericella(翘孢霉菌属)[27]。其中曲霉属与散囊菌属的相对丰度超过90%，是主要的优势菌属；在此基础上，其进一步利用传统形态学鉴定和真菌ITS分子鉴定相结合的方式，从三个茶厂（梧州、中茶、圣茂）选取了共14个样，分离鉴定得到5个属18种真菌。陈然等，从梧州各大茶企成品茶中进行微生物分离，发现不同茶企之间茶样的微生物差异巨大，最终通过耐热性和生长速度试验得到两株适合六堡茶发酵生产的金花菌，分别为“谢瓦氏散囊菌和冠突散囊菌”，经同源性比对发现筛选出来的冠突散囊菌与安化黑茶中的冠突散囊菌亲缘性相近[28]。欧惠算从梧州茶厂和中茶茶厂存放不同年限的成品茶中分离鉴定得到8个属，20种微生物[12]。周梦珍从梧州茶厂不同年份六堡散茶中分离出4种前人没有分离出来的菌株，其中曲霉属1种：Aspergillus versicolor（杂色曲霉变种）；枝孢属2种：Cladosporium oryzae（稻枝孢）、Cladosporium asperulation；假尾孢属1种：Pseudocercospora fici（无花果假尾孢）[29]。陈皓睿、唐万达等的分离鉴定结果进一步印证了成品茶中谢瓦氏曲霉、冠突散囊菌和Aspergillus tubingensis塔宾曲霉的存在，并通过进一步实验研究发现这三种曲霉能够产生多种水解酶和氧化酶，产酶能力高，是影响六堡茶品质风味的重要微生物[30,31]。杨雅焯等，利用高通量测序的方法对比六堡茶和重庆沱茶的微生物多样性区别，发现Blastobotrys是六堡茶的真菌优势菌，徐书泽也发现了此菌属。其次还发现，六堡茶中还含有大量细菌，其中鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）；乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属(Lactobacillus)、Saccharopolyspora是六堡茶的细菌优势菌[20],这与温志杰所发现的六堡茶中除了含有真菌微生物外，还含有大量细菌微生物的结论相一致。

表3 六堡茶成品茶微生物分离鉴定结果

Cladosporium（枝孢属） Penicillium oxalicum(草酸青霄) Penicilliuim mallochii Penicillium chermesinum(鲜红青霉) Stephanoascus Penicillium meleagrinum(斑点青霉) Bjerkandera(黑管菌属) Penicilliuim brocae Cercospora（尾孢菌属） Penicillium jiangxiense(江西青霉) Pseudocercospora（假尾孢属） Penicilliuim sclerotiorum(菌核青霉) Guehomyces Paecilomyces varioti(宛氏拟青霉) Rasamsonia（蓝状菌属） Blastobotrys raffinosifermentans Rossbeevera Rhodotorula mucilaginosa(胶红酵母) Emericella(翘孢霉菌属) Jaminaea angkoriensis Bjerkandera(黑管菌属) Sphingomonas sp.（鞘氨醇单胞菌） Lactococcus（乳球菌属） Cladosporium cladosporioides(枝状枝孢) Lactobacillus（乳杆菌属） Cladosporium uredinicola Saccharopolyspora Cladosporium oxysporum Cladosporium oryzae（稻枝孢） Cladosporium asperulation Stephanoascus ciferrii(西弗射盾子囊霉) Bjerkandera adusta(烟管菌) Cercospora capsicigena Pseudocercospora fici（无花果假尾孢）

3 展望

目前六堡茶微生物的研究，以渥堆和成品茶的微生物为研究对象的研究较多，陈化过程相对较少。基本没有查阅到与六堡茶初制过程微生物研究相关的报道。通常环境中，可培养微生物的数量占总体微生物数量不足1%，传统培养基培养分离鉴定的方式无法分离到非培养微生物和部分含量非常低的微生物[32,33]。因此，只利用传统平板培养分离的方法无法全面解析六堡茶微生物群落结构，也无法全面评价六堡茶微生物参与发酵、陈化过程的综合作用。传统的想法认为，六堡茶独特的品质风味是由主要的优势微生物群落影响形成的，但是目前仍没有合理的科学依据证明，一些低相对丰度的非优势微生物群落对六堡茶独特品质风味的形成没有重要影响作用。是否有一些关键的靶点微生物，数量级别未达到优势菌的标准，但是却能高效转化产生一些关键代谢产物，对六堡茶化学成分转化、品质风味形成、增强保健功能作用，有举重若轻的影响作用？仍需进一步借助靶向代谢组学的分析才能进一步去定论。如同近年来，冠突散囊菌发酵的红茶，其与传统发酵的红茶对比，就具有独特的品质风味和保健作用。六堡茶具有清热下火去湿气的功效[34]，而六堡茶具有这种独特的保健功能，除了独特的苍梧县群体种的茶树树种影响，推测加工过程微生物的参与起着举重若轻的作用。

通过对比不同学者的分离鉴定结果发现，在真菌分离鉴定方面：Aspergillus(曲霉属)、Eurotium(散囊菌属)、Penicilliuim（青霉属）、酵母属在不同加工阶段都有，而其中Aspergillus(曲霉属)、Eurotium(散囊菌属)是主要的优势菌群。在细菌分离鉴定方面，Lactococcus（乳球菌属）、Lactobacillus（乳杆菌属）Sphingomonas(鞘酯单胞菌属)是主要的优势菌群。此外还发现，不同厂家的茶样，微生物多样性的差异巨大，而六堡茶的风味、韵味也有所不同。实际调研时发现，一般新建的茶厂生产出来的六堡茶品质没有老茶厂的品质好，有些老茶厂搬迁时，甚至会把原来渥堆、陈化车间的木板、砖头都全部搬迁过去，目的就是尽可能还原老茶厂的生产环境，因此弄清楚形成不同厂家微生物的差异以及形成差异的原因，对探究六堡茶工厂可复制性以及离开梧州、离开广西，能否生产出一样高品质的六堡茶，具有重要意义。

随着新的测序技术的发展，六堡茶微生物多样性以及其作用的分析将会越来越明晰。届时结合微生物组学和代谢组学的分析方法，利用宏基因组和泛基因组技术进行分析，探究六堡茶微生物综合群体结构对六堡茶品质风味影响，将进一步为六堡茶特殊的微生物群落参与发酵和陈化过程的作用，提供合理的科学依据。

最后，对于六堡茶微生物应用研究方面。有研究证明，通过增加外源多酚氧化酶、果胶酶和纤维素酶能够显著提高黑茶多酚类物质、儿茶素类物质氧化转换形成茶黄素、茶红素、茶褐素等产物，促进茶叶中果胶和纤维素水解，从而使六堡茶茶汤品质更浓醇[35]。而加工过程各种酶的主要产生者就是各种微生物。因此，筛选出具有显著正相关，能够高效产酶的优势菌株，通过接种发酵的方式，能够大大加快六堡茶生产的效率和品质。此外，茶源微生物还对茶叶深加工具有重要影响。在普洱茶微生物研究中，利用从普洱茶中分离得到的茶源真菌进行液态发酵，能够高效生产得到茶褐素[36,37]，而茶褐素作为一种大分子活性成分，已被证实具有抗氧化、清除自由基[38]、治疗高血脂症的保健功效[37]。而六堡茶微生物在此方面的应用仍待进一步发掘。

目前微生物对茶叶品质影响的研究还只是停留在探究单一菌种或者组合菌种接种发酵后的简单化学成分变化规律的分析，其变化机理有待进一步研究。此外，六堡茶加工过程是微生物群落综合作用的过程，六堡茶化学品质成分的变化与微生物群落之间的关联，仍需利用生物信息学的方法去进一步挖掘。未来对于六堡茶微生物作用机理研究如果有了进一步突破，运用其作用机制，人工制作出各类微生物发酵菌剂，接种至毛茶中，就能人为地控制发酵进程，从而短时高效地生产出满足不同顾客需求的不同风味的六堡茶，这对进一步推动六堡茶产业发展，提升茶叶深加工技术，增加六堡茶产业链和产值，乃至推动黑茶产业发展，具有重大意义。