食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌检测能力验证结果分析

朱 奇，郑丹桂，陈玉翡，陆斌兴

合山市疾病预防控制中心，广西来宾 546500

单核细胞增生李斯特菌简称为单增李斯特菌，为革兰阳性短小杆菌或球杆菌，需氧或微需氧，最适宜的生长温度为30～37 ℃，4 ℃时仍可生长(冷增菌可提高检出率)，对营养要求不高，普通培养基上可生长，但在含血液、血清、腹水等成分的培养基上生长更好。单增李斯特菌在自然界中广泛存在，是一种食源性致病菌，并能够引起人畜共患病[1-3]。单增李斯特菌污染了食品，对人类的健康产生很大的威胁，易引起成人败血症和新生儿脑膜炎等疾病。在美国和欧洲等发达国家和地区发病率为2/100 000～8/100 000，病死率为20%～30%，或更高，被世界卫生组织列为关系食品安全的重要病原菌之一[4]。因此，在食品安全风险监测微生物检验中，必须加以重视。在乳制品、蔬菜、水果、海产品及肉类等食品中检出率较高，尤其在冷藏食品中检出率更高，在食物保鲜过程中有很大的安全隐患。

能力验证是通过实验室间的检测比对，以达到评估实验室的检测能力和校准能力，是实验室检测能力评价的重要手段，深受国内外实验室管理者的重视[5-6]。参加实验室能力验证，不仅可以加强实验室之间的技术交流，还能使彼此的检测水平有所提高。实验室通过能力验证，可以对采用的检测方法和使用的仪器进行确认，发现实验室在检测过程中存在的问题，并及时进行整改，以达到不断提高检测人员的检验水平的目的。为提高检验人员对该菌的检测能力，本中心微生物实验室参加了广西壮族自治区疾病预防控制中心组织的“食品中单核细胞增生李斯特菌”检测能力验证考核。同时使用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法和国家标准培养分离生化鉴定方法进行检测，并对两种方法结果进行比较分析，达到为实验室检测单增李斯特菌提供一种快速、准确的方法的目的。

1 材料与方法

1.1样品来源和性状 单增李斯特菌样品由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，编号为18-C800和18-J754，装在真空西林瓶中，呈冻干块状。

1.2检验方法 依据食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验：GB 4789.30-2016[7]中相关要求进行增菌、分离、鉴定和RT-PCR。

1.3检测项目 单增李斯特菌的定性检测。

1.4仪器与试剂 李氏菌增菌肉汤LB1、李氏菌增菌肉汤LB2、单增李斯特菌显色培养基、PALCAM琼脂平板、TSA-YE培养基、单增李斯特菌生化鉴定试剂盒、PCR扩增试剂等均在产品有效期内使用。除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，所需其他设备如下：恒温培养箱：(30±1)℃及(36±1)℃、冰箱2～5 ℃、RT-PCR扩增仪。

1.5实验室检测

1.5.1培养分离及生化检测 (1)取稀释好的样品液1 mL加入李氏菌增菌肉汤LB1中，(30±1)℃ 24 h培养后再取0.1 mL 加入李氏菌增菌肉汤LB2中(30±1)℃ 24 h培养。(2)取李氏菌增菌肉汤LB2于单增李斯特菌显色平板及PALCAM平板上分区划线于(36±1)℃培养箱中培养24～48 h。再挑取PALCAM琼脂平板和单增李斯特菌显色平板上典型或可疑菌落5个以上转接到TSA-YE培养基行纯化培养，于30 ℃培养48 h。

1.5.2生化试验 取TSA-YE培养基上典型菌落，按相关说明进行生化检测等。

1.5.3RT-PCR 取稀释好的样品原液，按试剂盒说明书操作，进行RT-PCR。

2 结 果

18-C800为阳性，18-J754为阴性。上报结果反馈，本实验室所鉴定的两份样品结果评价获得满意。编号18-C800和编号18-J754单增李斯特菌菌落特征、生化鉴定情况具体见表1、2；RT-PCR鉴定结果见表3。

表1 菌落特征

表2 生化检测结果

表3 RT-PCR鉴定结果

3 讨 论

随着经济的全球化，食品安全已经越来越受到人们的关注，而微生物污染已成为食品安全的首要问题。食源性致病菌是引发食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素。传统检测方法根据《食品卫生微生物学检验》国家标准中的检验流程进行操作，原理是依据不同病原体的化学组成或产生的代谢产物，通过一系列生化反应，对细菌进行鉴定。通常包括微生物形态学评价和培养特性评价两方面。传统的常规培养法的优点为无特殊设备要求，方法经典可靠。但是，该类检测方法需要进行增菌、分离等操作，耗时费力，完成整个检测流程周期较长，通常需要1周左右。近年来，随着PCR检测技术的快速发展，其在微生物检测中的应用也越来越广泛，RT-PCR作为PCR检测方法中的一种，因其具有较高的特异度和灵敏度，并且还有检测速度快、准确性高等优点，在食品微生物检测的应用中有较大优势。

常规分离鉴定方法虽然有较高准确度，但对检测人员操作能力和培养基质量等也有较高要求。在微生物检验过程中，应该重点关注培养基的质量，严格按照厂家提供的使用说明书进行保存、配制和使用。单增李斯特显色平板的优点是有较强选择特异性，缺点是对杂菌进行抑制的同时，也会干扰目标菌的生长，使其生长缓慢或抑制生长。PALCAM琼脂平板培养24 h的菌落太小，要48 h才可以观察到满意的结果，时间较久，但是PALCAM琼脂平板可以扩大目标菌的检测范围。而单增李斯特菌显色平板24 h就可观察到蓝绿色菌落。因此，在实验过程中这两种平板配合使用最好。显色培养基是一种新型分离培养基，其反应的灵敏度和特异度有了很大提升，与传统培养基相比，使菌落特征判断更加容易，提高了菌落分离的速度。在单增李斯特菌显色培养基上，可将可疑菌落进行多次反复分离纯化，以提高后续鉴定的准确率[8]。

常规培养法是国家标准方法，优点是普通实验室都能开展检测，成本较低；缺点是纯化、分离、鉴定步骤多，检测时间周期长，溶血试验操作难度较大，导致检测人员在经验不足的情况下，易产生漏检和假阳性。本研究通过RT-PCR对增菌液进行筛选检测的过程，省去了分离、鉴定过程中所用的时间，但是可能会出现假阳性的结果[5]，因此，在日常食品单增李斯特菌检测工作中，可以将RT-PCR方法和国家标准方法有机地结合起来，先通过RT-PCR方法对样品的增菌液进行快速筛选，出现阳性结果的样品，再按照国家标准方法进行目标菌的分离培养和生化鉴定，这样可以实现提高目标菌检测效率和准确性。为指导临床用药治疗和政府行政部门依法决策提供技术支撑。

通过参加实验室能力验证，实验室的检测质量得到进一步验证，取得了满意的结果，提高了实验室的检测能力，确保了检测结果的可靠性[9-10]。相信随着科技的发展，会有更多快速、灵敏、特异的方法得到广泛应用,为食品安全风险监测工作作出贡献。