水产品中的亚硝胺前处理方法优化及4种N-亚硝胺类化合物快速检测

孙卓，杨程程，许宏虹，战虎

（天津华测检测认证有限公司，天津 300000）

随着生活水平的提高，人们对饮食营养的要求日益增加。水产品中含有丰富的蛋白质、脂肪、人体必需氨基酸，因此水产品经过不同加工后成为餐桌上常见的美味佳肴。但是在进行腌制、油炸过程中，水产品营养物质会转化成少量N-亚硝胺类化合物[1]，该物质是公认的具有较大毒害作用的污染物，也是已知的强致癌物之一，会对人体健康造成严重影响，过量摄入含有亚硝胺的食物后，人体会出现肝脏损伤，血小板破坏，乃至全身中毒[2]等表征。

随着人们对亚硝胺的致癌机理[3]深入了解，对如何有效监管食品中的亚硝胺显得尤为重要。GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定水产动物[4]及其制品中N-二甲基亚硝胺[5]的限量值为4.0 μg/kg。GB 5009.26—2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》中提供了两种检测方法。从仪器角度分析，气相色谱-热能分析法[6]由于仪器价格昂贵，不适用于一般实验室。气相色谱-质谱法，由于结果离子信息少，定性不准确等问题，容易产生N-二甲基亚硝胺假阳性的结果，而且很难消除样品基质干扰。从前处理角度分析，水蒸气蒸馏法[7]的试剂消耗量大，从提取到浓缩过程时间长，易造成目标化合物损失，回收率不稳定而且批量检测存在一定的局限性。由于标准对N-二甲基亚硝胺限量要求低，因此传统试验仪器与前处理方法不能满足水产品中N-二甲基亚硝胺检测的准确度要求。相比之下，QuEChERS方法改进了样品前处理方式，通过对样品提取、净化、直接进样，利用基质分散萃取机理，进而达到吸附干扰物，保留目标物与净化样品的目的。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

扇贝柱、鲜虾滑、巴沙鱼片、墨鱼丸：市售。

4种N-亚硝胺类化合物标准储备液[N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亚硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亚硝基正丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA），纯度均大于 98.0%，质量浓度均为100 mg/L]：安谱实验科技股份有限公司；QuEChERS净化填料除脂分散净化包、除脂萃取盐包：美国安捷伦公司；乙腈、正己烷（色谱纯）：美国Thermo Fisher公司。

1.2 仪器

8860-5977型气相色谱-串联质谱仪（配电子轰击离子源）：美国安捷伦公司；Vortex Genius 3型漩涡振荡器：德国IKA公司；MGS-2200G型氮吹仪、RV10型旋转蒸发仪：日本东京理化公司；KQ-500DV型超声波清洗器：昆山舒美有限公司。

1.3 标准曲线绘制

取亚硝胺类化合物混合标准储备液，用正己烷稀释并配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准工作液，放于棕色储液瓶，在-18℃冰箱保存。临用时，移取上述配制好的工作液，用正己烷配制成浓度分别为1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的标准溶液，现用现配，绘制标准曲线。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取

称取10 g（精确到0.000 1 g）水产样品，放进50 mL离心管，加入20 mL正己烷，在室温（35℃以下）以5 000 r/min的转速离心5 min，样品残渣再用10 mL正己烷重复提取3遍，合并正己烷提取液于100 mL离心管中，使用涡旋振荡器振荡1 min，在室温（35℃以下）用速率为5 000 r/min的离心机离心3 min，弃去正己烷层，重复两次，然后转移到容量瓶中进行定容，等待净化。

1.4.2 净化

使用移液器量取试样1.5 mL待净化溶液，置于含N-丙基乙二胺混合吸附剂50 mg、硅胶吸附剂150 mg以及无水硫酸镁100 mg的2 mL离心管中，使用漩涡振荡器振荡30 s，使试样混匀，放入转速为12 000 r/min的离心机离心3 min，取上清液待气相色谱-串联质谱仪测定使用[8]。

1.5 空白基质匹配混合标准溶液的配制

提取3种空白基质水产品样品，待净化液减压旋蒸至干后，加入2.0 mL质量浓度分别为1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的混合标准工作溶液复溶，涡旋振荡，量取1.5 mL溶液振荡后进行QuEChERS净化，即可获得空白基质混合标准溶液，现用现配。

1.6 基质效应（matrix effect，ME）计算

由于质谱分析会普遍存在基质效应，客观存在的基质效应对方法的精密度、灵敏度以及准确度都会造成影响[3]。本试验前处理过程会用到大量有机试剂，而且水产品基质复杂，有可能会对目标物产生一定影响。本文参考李婷等[9]的研究方法，通过先萃取后添加的方法，配制质量浓度为0.100 mg/L的4种N-亚硝胺类化合物标准溶剂以及空白基质匹配校准溶剂，在同样条件下进行分析，根据公式（1）计算ME。

式中：Pm为空白基质匹配校准溶液中N-亚硝胺类化合物的响应值；Ps为标准溶液中N-亚硝胺类化合物的响应值。

当ME=0时，表示溶液中没有基质效应；当ME＜0时，表示溶液中存在基质抑制；当ME＞0时，表示溶液中存在基质增强效应。试验所得4种N-亚硝胺类化合物在水产品中都存在基质增强效应。在基质效应均存在的情况下，采用基质匹配标准曲线定量，就可以在一定程度降低基质效应的影响，提高定量结果的准确性。

1.7 色谱条件

色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为220℃，不分流进样模式。载气为氦气，纯度为99.99%，流速为1.0 mL/min。升温程序：30℃，保持3 min，以5℃/min升至100℃，以30℃/min升至240℃，保持5 min；溶剂放空模式进样：放空温度为30℃，放空流速：100 mL/min，放空时间为0.42 min，以 600℃/min速率升温至 300℃，进样体积：5 μL。

1.8 质谱条件

离子源：EI，离子源的温度为230℃，四极杆的温度为150℃，接口的温度230℃，电子能量为90 eV，碰撞能量均为15 eV。4种挥发性N-亚硝胺类化合物的保留时间、产物离子[10]、前体离子以及其它质谱参数见表1。

表1 4种N-亚硝胺类化合物的保留时间、产物离子以及其他质谱参数Table 1 Retention times，product ions and other MS paramerters of the four N-nitrosamine compounds

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 去脂方式的选择

对于大多数水产品，QuEChERS的净化填料具有较好的去除杂质和油脂的作用[11]。但对于油脂含量较高的动物性食品，在净化浓缩后，会有相对明显的油脂吸附在玻璃容器管壁上。因此试验尝试多种不同的净化、萃取去脂方式。凝胶色谱净化方法弥补上述缺陷，在确保精密度和准确度的同时提高了检测效率。

2.1.2 净化条件的优化

使用乙腈进行提取，鸡心瓶壁内会留有大量复溶不能溶解的油状残留物，如果增加溶剂使用量，会导致检测方法的检测限降低。同时大量油脂会使得硅胶粉末和N-丙基乙二胺填料不能将样品净化干净，致使色谱基线[12]响应偏高、回收率差、仪器污染等，同时还会存在其它明显问题。

1）上机样品量少，如果增加上机样品量会导致目标物分散，造成收集时间延长，杂质数量增加等多种影响。

2）前处理时间较长，净化1个样品基本需要1 h以上。

以上问题在一定程度上限制了凝胶色谱仪的净化作用，为了更好优化前处理阶段去脂效果，参考文献[13]的方法，在乙腈提取过程中添加正己烷溶液（乙腈饱和）进行去脂。与未经去脂或者QuEChERS净化的效果进行对比，考察净化效果。通过回收率考察发现，具有极性的N-亚硝胺类化合物在具有非极性的正己烷中几乎未被分解，即使用正己烷多次去脂也不会影响乙腈提取液中的N-亚硝胺类化合物含量。因此确定采用正己烷去除乙腈层中的油脂。

2.2 定性、定量方法的选择

水产品成分复杂，经常会受到基质效应的影响，而且N-亚硝胺类化合物在前处理过程中不稳定，为了更好地对目标物进行定量、定性分析，试验采用质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）[14]模式进行检测，使用混合基质标准溶液和内标法进行定量，既排除了基质干扰，又弥补了前处理对整体回收率的影响。

2.3 标准曲线方程、检出限和定量限

称取10.00 g试样，加入100 μL混合内标溶液，配制成质量浓度为 5、10、20、30、50、100、150 μg/L 的 N-亚硝胺类化合物溶液，按照标准方法进行处理，在仪器工作条件下进行测定，得到4种N-亚硝胺类化合物的线性回归方程，见表2。

表2 4种N-亚硝胺类化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation corfficient，limit of detection and limit of quantitation of the 4 N-nitrosamine compounds

由表2可见，4种N-亚硝胺类化合物的线性关系良好，相关系数为0.9985～0.9999。检出限为0.05 μg/kg～0.10 μg/kg，定量限为 0.1 μg/kg～0.5 μg/kg。本方法灵敏度高，线性范围广。

2.4 精密度和回收试验

将不同质量浓度水平的混合标准溶液添加到空白水产品试样中，分别制成 1.0、3.0、10.0 μg/kg的加标样品，按试验方法每个浓度平行测试6次，得出回收率和测定值的相对标准偏差，结果见表3。

表3 4种N-亚硝胺类化合物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviation of the 4 kinds of N-nitrosamines compounds（n=6）

结果显示，经QuEChERS前处理的样品回收率较未经处理的样品回收率数值偏高，表明QuEChERS方法在准确性方面具有一定的优势。

3 结论

本文使用改进的QuEChERS方法，建立了水产品中4种N-亚硝胺类化合物的气相色谱-质谱联用仪分析方法，前处理快捷简单、便于操作，目标化合物损失较低、回收率较高，具有较高的准确性，适用于大批量水产品的检测，实际检测运用良好，对日常检测工作具有一定的指导和借鉴意义。该方法也可以应用于高油脂含量的各类食品中的N-亚硝胺类化合物的测定。