哈密地区奶疙瘩微生物多样性研究

张苗苗，蔡文超，旦巴达贡，单春会，李宝坤，肖石高，郭壮*

（1.湖北文理学院湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；2.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003；3.湖北澳利龙食品股份有限公司，湖北 宜昌 444100）

发酵乳制品是原料乳经微生物自然发酵，通过不同的加工方式制作而成，包括酸马奶、奶酪、乳酒、酥油和马奶酒等[1]。发酵乳制品中微生物类群较为丰富，赋予了产品独特的风味，因而对发酵乳制品中微生物的群落结构进行解析是极为必要的。张冬蕾[2]对新疆地区昭苏县和特克斯县酸牛奶样品中的微生物进行研究发现，优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes），优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota）；优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus），优势真菌属为酿酒酵母属（Saccharomyces）。ALEJANDRO等[3]对墨西哥塔巴斯科州的牛奶、发酵乳清、凝乳和成熟奶酪的细菌进行分析发现，在原料奶中主要为大球菌属（Macrococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和水杆菌属（Hydrobacillus）；乳清、凝乳和奶酪中主要为Streptococcus和Lactobacillus。SESSOU等[4]对贝宁和尼日尔地区的Wagashi奶酪和发酵牛奶进行研究同样发现，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces Max）和Saccharomyces是主要酵母菌种。由此可见，不同地区生产的发酵乳制品微生物群落结构存在较大的差异。

奶疙瘩是新疆哈萨克族居民经常食用的一种传统乳制品，其生产工艺和浓缩型酸奶或酸奶干酪类似[5]。奶疙瘩的制作多采用手工生产，将自然发酵的牛（羊）奶去水后自然干燥而成[6]。然而目前关于奶疙瘩的研究一般集中在生产工艺[7]、风味组成[8]以及乳酸菌的分离[9]等方面，而对其微生物群落结构的研究较少。高通量测序技术具有准确性高、测序深度广和样本测序量大的优点[10]，目前在酸奶[11]、酸马奶[12]、驼奶[13]和奶酪[14]等发酵乳制品中均有了一定的应用。新疆维吾尔自治区哈密地区，居住的少数民族众多，主要有维吾尔族、哈萨克族、回族、蒙古族以及满族等，是丝绸之路的咽喉，属典型的温带大陆性干旱气候，为全国日照时数最多的地区之一[15]。

本研究采用第二代高通量测序技术，对采集自新疆维吾尔自治区哈密地区的4份奶疙瘩样品中的真菌和细菌的群落结构进行了解析，以期为后续奶疙瘩的工业化生产以及优良菌种的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

基因组提取试剂盒：德国QIAGEN公司；引物SSU0817F/SSU1196R、338F/806R：天一辉远生物科技有限公司合成；DNA 聚合酶、dNTPs mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）缓冲液：北京全式金生物技术有限公司。

VeritiTM96孔梯度PCR扩增仪：美国AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Thermo Fisher公司；CR21N高速冷冻离心机：日本HITACHI公司；Fluor Chem FC3型化学发光凝胶成像系统：美国ProteinSimple公司；MiSeq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R930机架式服务器：美国DELL公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的采集

奶疙瘩样品采自新疆维吾尔自治区哈密地区伊州区、伊吾县和巴里坤哈萨克自治县牧区，共采集了4份，编号分别为H1～H4。在进行细菌和真菌多样性分析时为便于区分，HB1为H1样品的细菌编号，而HF1为H1样品的真菌编号，其他样品编号规则一致。

1.2.2 样品微生物宏基因组DNA提取、PCR扩增及高通量测序

在使用试剂盒对奶疙瘩样品中微生物宏基因组DNA提取的基础上，进行核苷酸序列的PCR扩增。参照董蕴等[16]和周书楠等[17]的方法，对细菌16S rRNAV3-V4区和真菌18SrRNAV4-V5区进行PCR扩增。PCR产物邮寄至上海美吉生物医药科技有限公司，使用MiSeq PE300高通量测序平台进行高通量测序。

1.2.3 生物信息学分析

参照李娜等[18]的方法，将序列进行拼接，然后对拼接好的序列进行质控和筛选。使用QIIME分析平台[19]对微生物多样性进行分析，使用PyNAST将质检合格的序列对齐[20]，使用UCLUST划分得到各分类操作单元 （operational taxonomic units，OTU）[21]，继而 使用Greengenes[22]和 RDP（ribosomal database project，Release 11.5）[23]数据库以及SILVA[24]数据库分别对细菌和真菌的OTU代表性序列进行同源性比对，然后对Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数3个Alpha多样性指标进行分析，最后对优势细菌属和优势真菌属的相关性进行研究。本研究将存在于所有样品的OTU定义为核心OTU，将样品中平均相对含量大于1.0%细菌或真菌的门或属定义为优势门或属。

1.3 数据处理

本研究使用Office 2016绘制瀑布图，使用Origin 2017绘制柱状图和散点图，使用R软件（v4.2.0）的UpSetR、Waterfall和Corrplot软件包绘制其他图。

2 结果与分析

2.1 奶疙瘩中细菌和真菌Alpha多样性分析

Alpha多样性指数可以用来反映样品中菌群的多样性，本研究选取Chao1、Simpson和Shannon 3个常用指数来分析奶疙瘩样品中的微生物多样性。Chao1指数与群落的丰富度呈正相关；Shannon指数与Simpson指数呈负相关，Shannon指数越高表示群落多样性越大，而Simpson指数越高表示群落多样性越小[25]。样品Alpha多样性指数见表1。

表1 样品Alpha多样性指数Table 1 Alpha diversity index of samples

如表1所示，通过比较Chao1指数可知，HB2样品中细菌的群落丰富度最大，Chao1指数为798，而HF3样品中真菌群落丰富度最大，其Chao1指数为2 969。通过比较Shannon指数可知，细菌多样性HB1>HB4>HB2>HB3，真菌多样性HF3>HF2>HF1>HF4。由表1还可知，不同奶疙瘩样品间的微生物多样性和丰富度存在较大差异，样品中真菌的丰富度比细菌高但真菌的多样性整体稍低于细菌。为进一步评估本研究的测序深度是否满足后续要求，对Shannon指数的变化趋势进行了研究，结果如图1所示。

图1 细菌和真菌的Shannon曲线Fig.1 Shannon curves of bacteria and fungi in samples

本研究中4个奶疙瘩样品细菌和真菌的平均有效测序深度分别为41 587条序列和49 637条序列，由图1可知，样品细菌和真菌的Shannon曲线均在测序量约为5 000条时趋于平稳，表明本研究测序深度足够，测序数据可满足后续要求。

2.2 基于门和属水平奶疙瘩中微生物群落结构分析

本研究对代表性序列进行同源性对比发现，4个奶疙瘩样品中共鉴定出了24个细菌门和9个真菌门。基于门水平细菌和真菌相对含量的比较分析见图2。

图2 基于门水平细菌和真菌相对含量的比较分析Fig.2 Comparative analysis of relative contents of bacteria and fungi at phylum level

如图2所示，平均相对含量大于1.0%的细菌门有5个，分别为硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和梭杆菌门（Fusobacteria），平均相对含量分别为44.47%、41.63%、5.77%、3.24%和2.75%；核心真菌门有3个，主要隶属于子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota），平均相对含量分别为77.10%、11.74%和7.36%。滕香旭[26]对酸奶、嚼克和奶豆腐等内蒙传统发酵乳制品中微生物多样性进行研究发现，Firmicutes和Bacteroidetes为优势细菌门，Ascomycota为优势真菌门。刘杨柳[27]发现Proteobacteria和Firmicutes亦为新疆3个不同地区传统发酵奶疙瘩中的优势细菌门，雷炎等[28]发现新疆塔城地区奶豆腐中的优势细菌门为Proteobac－teria、Frimicutes、Actinobacteria 和 Bacteroidetes，上述报道均与本研究相同。

在属的分类水平上，共鉴定出426个细菌属和57个真菌属，其中细菌和真菌平均相对含量大于1.0%的优势菌属分别为14个和11个，其分布情况如图3所示。

图3 基于属水平细菌和真菌相对含量的比较分析Fig.3 Comparative analysis of relative contents of bacteria and fungi at genus level

由图3A可知，奶疙瘩样品中优势细菌属和平均相对含量分别为乳杆菌属（Lactobacillus，21.34%）、醋杆菌属（Acetobacter，12.44%）、不动杆菌属（Acinetobacter，9.86%）、乳球菌属（Lactococcus，9.06%）、链球菌属（Streptococcus，6.64%）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia，5.20%）、埃希氏菌属/志贺氏菌属（Escherichia/Shigella，2.70%）、沙门氏菌属（Salmonella，2.60%）、纤毛菌属（Leptotrichia，2.27%）、肠球菌属（Enterococcus，1.76%）、普雷沃氏菌属（Prevotella，1.47%）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia，1.43%）、放线菌属（Actinomyces，1.41%） 和巨大球菌属（Macrococcus，1.15%），Lactobacillus在样品HB3中含量为80.84%，而在HB1、HB2和HB4中仅占0.88%、0.78%和2.86%，由此说明不同样品间细菌多样性存在差异。

由图3B可知，优势真菌属及平均相对含量分别为毕赤酵母属（Pichia，19.53%）、曲霉属（Aspergillus，18.94%）、耐碱酵母属（Galactomyces，15.87%）、巴克斯霉属（Backusella，6.61%）、寡囊盘菌属（Thelebolus，6.29%）、黑葱花酵母属（Filobasidium，6.21%）、德巴氏酵母属（Debaryomyces，1.49%）、青霉属（Penicillium，1.26%）、假丝酵母属（Candida，1.19%）、丝孢酵母属（Trichosporon，1.12%）和鹿茸属（Cutaneotrichosporon，1.10%），但仍有13.70%的真菌无法鉴定到属，间接说明奶疙瘩样品含有丰富的真菌群落。

新疆地区乳制品种类繁多，包含酸牛奶、酸马奶、酸驼奶、奶疙瘩和奶酪等多种传统发酵食品，其中蕴含了丰富的微生物资源。XIE等[29]从新疆伊犁牧区的传统发酵马奶酒中分离得到了68株Lactobacillus。李伟程等[30]发现Lactobacillus为新疆伊犁牧区酸马奶中的优势细菌属，Galactomyces为优势真菌属，李王强等[31]发现Pichia和孢圆酵母（Torulaspora）为新疆塔城地区奶酪中的优势酵母，上述研究与本研究结果基本一致。

2.3 基于OTU水平奶疙瘩中微生物群落结构分析

OTU在样品中的分布如图4所示。

图4 基于OTU的细菌和真菌UpSet分布图Fig.4 OTU based UpSet diagram of bacteria and fungi in samples

由图4A可知，样品HB1～HB4中OTU总数为634、764、213、656个，核心OTU数为58个，占OTU总数的1.66%，但包含83790条序列，占总序列数的50.37%。由图4B可知，样品HF1～HF4中OTU总数为663、781、1 429、645个，核心OTU数仅为36个，占OTU总数的1.26%，但包含98 956条序列，占总序列数的49.84%。细菌和真菌中均有7个平均相对含量大于1.0%的核心OTU，其相对含量如图5所示。

图5 平均相对含量大于1.0%的细菌和真菌核心OTUFig.5 Core OTUs of bacteria and fungi with an average relative content greater than 1.0%in samples

由图5A可知，细菌中核心OTU所包含序列数占总序列数的 50.37%，其中 OTU263、OTU965、OTU1694、OTU1750、OTU2433、OTU2949 和 OTU3240 分别隶属于Lactococcus、Lactobacillus、Acetobacter、Ralstonia、Streptococcus、Escherichia/Shigella 和 Acinetobacter。由图 5B可知，奶疙瘩中真菌核心优势OTU所包含序列数占总序列数的 49.84%，其中 OTU25、OTU167、OTU744、OTU850、OTU1552、OTU2222 和 OTU2751 分别隶属于Aspergillus、Debaryomyces、Digitaria、Backusella、Pichia、Filobasidium和未鉴定多毛霉菌纲（Dothidecomycetes）。由此可见，奶疙瘩中的核心细菌类群主要以Lactobacillus、Acetobacter、Acinetobacter 和 Lactococcus 为主，累计平均相对含量为47.27%，核心真菌群主要以Pichia、Aspergillus和Backusella为主。本研究通过分析发现奶疙瘩中还存在一定的Salmonella等常见的有害致病菌，可能引起病原菌感染、发热和食物中毒[32]。

本研究进一步对奶疙瘩中优势细菌属和真菌属之间的相关性进行了探究，如图6所示。

图6 细菌和真菌优势菌属的秩相关热图Fig.6 Rank correlation heat map of dominant genera of bacteria and fungi in samples

由图 6可知，Galactomyces与 Streptococcus呈显著负相关（P＜0.05，r=-0.924），与 Macrococcus与呈正相关（P＜0.05，r=0.966），与 Escherichia/Shigella呈极显著 正 相 关 （P ＜0.001，r=0.999），Aspergillus 与 Leptotrichia、Prevotella和 Actinomyces均呈显著正相关（P＜0.05）；Candida与 Enterococcus呈显著正相关（P＜0.05，r=0.966）。由此可见，奶疙瘩中细菌和真菌类群可能存在一定的共生关系。

3 结论

哈密地区奶疙瘩中的细菌门主要为Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria，真菌门主要为 Ascomycota、Basidiomycota 和 Mucoromycota，细菌属主要为 Lactobacillus、Acetobacter，真菌主要为 Pichia、Aspergillus和Galactomyces，奶疙瘩中细菌和真菌类群可能存在一定的共生关系。